肾靶向基因传递策略

作者：蒋庆琳， 廖洪利， 杨倩 谢静， 宋丽， 昝旺， 臧志和

【摘要】 自从1991年以来，对于许多研究者来说肾靶向基因传递已经成为现实。但是迄今为止，在肾病治疗方面仍然没有一种可靠的基因传递技术。在现行的试验条件下，针对于肾脏某一特定的结构，有一些体内基因传递的方法，例如:日本凝血病毒脂质体复合物、针对于肾小球细胞的腺病毒灌注方法等。虽然使用逆转录病毒载体和腺病毒载体对于肾靶向的基因传递是一个理想的方法，但是通过静脉给药却不能够有效地靶向到肾脏，特别是肾小管，因为绝大多数DNA将会在肺组织被捕获。SUZUKI研究小组发现GlcSC8是一个很好的肾靶向载体。

【关键词】 肾靶向; 基因; 脂质体

　　【Abstract】 Kidney targeted gene transfer has been a realistic goal for many researchers since 1991，but unfortunately，so far there has been no reliable gene transfer technique for gene therapy of renal diseases.However，at the experimental level，several in vivo gene transfer methods have attempted to target certain renal structures，for example，the HVJliposome method and renal perfusion of adenovirus for glomerular cells.Since retroviral vectors require replicating cells for transduction and adenovirus based vectors tend to induce immune reactions，liposomegene delivery system appears to be an ideal method for gene therapy targeted to the kidney.The intravenous route is not efficient for gene transfer targeted to the kidney，particularly to the tubules，because most of the DNA is trapped in the pulmonary.Gene therapy is a potential treatment modality for tissue and endothelial cells.SUZUKI groups confirm that GlcSC8 can act as a renal targeting vector.

　　【Key words】 kidney targeting;gene;liposomes

　　在1990年，基因治疗首次被用于患有人类腺苷脱氨激酶缺乏症(ADA)的女孩的治疗[1]。通过将ADA基因转运到T淋巴细胞并长时间的表达，这个患有免疫缺陷症的女孩重返了校园。这一病例的成功使得基础研究向临床应用迈进了一大步，从此以后对于基因治疗的兴趣在学术界蔓延开了。从这以后的7年时间里，超过200个基因治疗的方案获得了批准并且有2 100个病人在接收治疗后得到了康复[2]。在临床上，基因治疗就是将遗传物质转运到躯体细胞以纠正基因的紊乱。基因治疗的原理就是在最基本的水平上对疾病因素的校正。基因治疗的应用已被拓宽到诸如:癌症(cancer)、人类免疫缺陷病毒(HIV)以及心血管疾病的治疗。迄今为止，有2/3用基因治疗的疾病是恶性肿瘤，而先天性缺乏疾病仅占10%.

　　基因治疗主要基于以下几个方面:①纠正细胞中缺陷基因的异常表达。②转入外源性基因进入细胞从而添加新的功能。③通过诱导对抗基因来抑制细胞不必要的活性。基因治疗中最引人注目的方面就是诱导一个功能化的分子进入细胞，因为转运蛋白质通过细胞质屏障到靶细胞比转运DNA困难得多。1995年，美国国家健康研究所的Orikin和Motulsk发表了关于基因治疗的一篇报道[3]。他们提出了一些重要的论点，特别是对于基因治疗的基础研究很薄弱的地方。他们认为更多的注意力应该放在对疾病的病理生理学的理解上，从而更好地选择哪个细胞作为靶点、哪个基因能最有效地完成治疗。基因传递技术的发展，特别是用于传递基因的载体的发展，对于基因传递效率的改善是至关重要的。最近的综述对人类基因治疗的进展作了阐述[49]，有一些也对肾病治疗的应用作了阐述[1014]。本综述主要对体细胞基因传递技术以及在肾病学上的应用作一阐述。

　　1 针对于基因传递的策略

　　基因传递技术主要分为两个范畴:病毒载体和非病毒载体。对于人类基因治疗，75%的临床试验都采用病毒载体，因为病毒载体在转染率上优于非病毒载体。

　　1.1 病毒载体

　　逆转录病毒:因为逆转录病毒的基本生物学性质已被广泛的研究[6]，有超过50%的临床试验都使用它[2]。这些病毒于特定的细胞受体相结合并将病毒RNA染色体组转运到细胞质。RNA反转录得到前病毒DNA，前病毒DNA进入细胞核并转变为双链DNA随机集合到宿主的染色体组。表达片断与染色体组的稳定结合对于转运基因的长期表达是有利的。逆转录病毒载体的主要缺点在于靶细胞必须复制结合到宿主染色体组。由于肾脏许多靶细胞都是无法分离的，几乎限制了以逆转录病毒为载体的基因传递系统在基因治疗中的所有体外试验的应用。为了克服这一问题，发展了一类psudotype载体[15]。逆转录病毒系统已经发展形成了两种病毒表现形式[16]:人类免疫缺陷病毒HIV和水疱性口炎病毒。HIV载体能够在体内有效地传导基因进入非增殖期细胞。使用逆转录病毒有致癌的风险，随机的结合可能会导致致癌基因活性的突变。

　　腺病毒载体:重组腺病毒已经被用于基因传递载体。天然的腺病毒是一个双链的DNA病毒，它的表达被病毒染色体中4个早期的区域和5个晚期的区域所控制。重组腺病毒载体从第一个早期区域删除，此时已编码了几乎所有的功能蛋白，包括这个病毒的反作用子蛋白。这样一来，重组腺病毒理论上不能自身复制。腺病毒载体具有高效价的显著优点，有希望在基因传递中表现出极高的表达水平。由于腺病毒能够侵入分裂期和休眠状态的细胞，它在传递相对较大的基因进入休眠或分裂末期的细胞具有明显的优势。但是，由于腺病毒不能够与宿主细胞的染色体结合，基因转染的表达只能维持在数周到数月之内。腺病毒基因传递关键的障碍就在于它会诱发免疫应答。宿主的免疫应答包括起初的非特异性炎症以及随之而来的细胞毒T淋巴细胞介导的清除机制引发的细胞和免疫应答[17]。因此，腺病毒载体不能用于重复的基因传递。人们试图去得到无害的腺病毒载体，第二代腺病毒载体产生了，通过在E2区域插入一个热敏突变子来抑制主要晚期区域的反作用子[18]。因此，第二代腺病毒载体延长了传递基因的表达时间。

　　1.2 非病毒载体

　　脂质体介导的基因传递:脂质体介导的基因传递具有两个方面的概念:静电形式和内吞形式。阳离子脂质由于其廉价和高效性而被用于制备阳离子脂质体来研究体内基因传递已长达10年之久。它的主要成分是N[1(2，3二油基氧)丙基]N，N，N，氯化三甲铵(DOTMA)。DNA脂质体复合物通过吞噬作用进入细胞，阳离子脂质体内部包裹遗传物质。理论上来说，脂质体对于被包裹的遗传物质没有大小限制。脂质体介导的基因传递缺点就是在于表达率明显低于病毒载体。最近Wheeler等[19]报道了一种新的阳离子脂质体，其组分为N(3氨丙基)N，N二甲基2，3二(十二烷氧)1溴丙铵/二油酰磷脂酰乙醇胺(GAPDLRIE/DOPE)。Lee等[20]也报道了一个新的组分。这些新的阳离子脂质体对于体内基因传递效率有较大的改善。脂质体介导的基因传递系统的另一个不足就是对细胞的靶向性不好。

　　日本血凝病毒(HVJ)脂质体复合物:HVJ属于副黏液病毒家族，在其外膜含有HN和F糖蛋白而具有促融性，这一性质已被应用于HVJ脂质体介导的基因传递[21]。HN和F糖蛋白的协同作用使得病毒和细胞融合[22]。HVJ脂质体为内吞式脂质体，其优点有以下几个方面:①HVJ脂质体复合物能有效地将DNA转运到休眠细胞。②通过HVJ脂质体复合物介导，DNA能直接介导进入细胞质并且迅速易位到细胞核。③通过HVJ脂质体复合物介导的潜伏期相对较短(通常在5～30 min)。④HVJ脂质体复合物可以转运大于50 Kb的双链DNA。⑤在小动物试验中，HVJ脂质体复合物转运系统没有表现出细胞毒性。⑥虽然HVJ抗体被诱导，但是HVJ脂质体复合物的重复使用并不影响转染率。⑦在细胞核内，寡聚脱氧核苷酸具有对DNA的长期记忆和稳定的作用。HVJ脂质体为内吞式脂质体，其缺点为:①基因表达时间短暂。②不能将基因靶向传递。③载体的制备方法复杂且不稳定。

　　1.3 新型脂质体

　　通过连接抗体或配体，脂质体可以将遗传性物质转运到特异的细胞。比如说:接有对应大鼠组织相容性抗原抗体的脂质体比单独的脂质体DNA复合物更能有效地将DNA传递到靶细胞[23]。最近Fender报道了一个新的方法，使用一个十二面体(通过病毒附着于细胞产生细胞内摄作用而释放出的一种腺病毒蛋白)[24]。他们用其作为阳离子脂质体的组分来改善转染率。这个构想可能会产生出一种在脂质体表面具有遗传性蛋白的超级脂质体，从而能将DNA传递至每一个独立的细胞进行表达。

　　2 肾靶向基因传递

　　肾靶向基因传递的策略见表1.

　　3 肾小球靶向

　　体内肾小球靶向的基因传递有两种方法:HVJ脂质体复合物及腺病毒灌注。HVJ脂质体复合物介导的基因传递可选择性地将基因传递至肾小球，特别是肾小球系膜细胞[25，26]，但是这种作用机制目前并不清楚。就算有基因传递的效率很高，表达还是仅有15%～35%，表达时间也仅有7 d.这样以来，HVJ脂质体复合物介导的基因传递的主要问题就在于转染率低和表达时间短。　表1 肾靶向基因传递的策略

　　通常动脉间注射腺病毒不能将基因成功传递至肾脏。Tryggavason首先报道了用腺病毒将基因成功传递至肾脏。他们通过肾灌注的方法注入腺病毒载体，4 d以后在肾小球观察到了传递基因的表达并且这个表达持续了3周。但有意义的是，他们并没有在内皮细胞和肾小管细胞观察到基因表达，由此而见，腺病毒的灌注方法能高效地将基因靶向至肾小球。

　　4 肾小管靶向

　　肾小管由十几种不同的细胞组成，主要是维持体内水和电解质的平衡。最近在分子肾病学的研究揭示了肾脏的非均一性，比如说各种各样的通道、酶等。因此，对肾脏机能障碍的治疗应该从对肾脏某一部分的特定分子的治疗下手。然而，迄今为止还没有靶向于肾小管细胞的基因传递技术。屏障主要有两个方面:①如果通过肾动脉给予，遗传物质首先就会到达肾小球。②用逆行途径将其传递到附近是很困难的。

　　静脉注射是传递至近小管的最简单的办法。Rappaport等[27]将32P标记的寡聚脱氧核苷酸静脉注射，32P标记的寡聚脱氧核苷酸首先浓集于肾脏和肝脏并且在注射后30 min内就在近小管处探测到，实例见表1.

　　5 临床肾病基因治疗策略——反义治疗

　　反义寡核苷酸技术是将小分子与靶基因序列互补的寡核苷酸(DNA)导入细胞，与mRNA结合，激活核酶RNase H，促使mRNA降解，抑制转录过程，从而抑制靶基因的表达。与药物相比，反义寡核苷酸技术有高度的特异性，寡核苷酸分子的设计和合成也较容易。近年来国外有较多关于ASODN用于肾病治疗研究的报道[2830]。

　　　　

　　Noiri等[31]采用反义寡核苷酸来抑制NO合成酶(iNOS)，以期在缺血肾中阻止NO产生。单次注射iNOS ASODN 就能缓解急性肾衰，减少形态病变。Oberbauer等[32]研究通过硫代磷酸酯ASODN来抑制钠磷(Na/Pi22)共转运子。小鼠单剂量静脉注射ASODN可拮抗mRNA，也可抑制Na/Pi22共转运泵的蛋白质，最终表现为近端小管对磷酸盐的管腔吸收降低。Wang等[33]向小鼠肾基质中多巴胺1A受体注射了一种荧光标记的硫代磷酸酯ASODN。24 h后在小管上皮细胞和肾内脉管系统中都发现了荧光标记物，多巴胺1A受体蛋白减少35%，尿钠排泄和尿量也有所减少。先用硫代磷酸酯细胞间粘附分子1(ICAM1)ASODN灌注离体鼠肾，局部缺血处理30 min后，再将处理过的鼠肾移植到双侧肾切除的小鼠上，可降低移植对肾功能的损害[34]。通过静脉注射细胞间粘附分子(ICAM) ASODN，Chen等[35]观察到ICAM1表达显著降低，发炎细胞的渗透和单边输尿管阻塞小鼠肾中细胞外基质的蓄积都明显降低。

　　重复向肺肾血管炎综合征小鼠注射骨桥接素ASODN，可阻止肾小管骨桥接素的表达，减轻单核细胞过滤和保持肾血流，未发现骨桥接素在mRNA水平的变化和肾小球组织学或蛋白尿的改变。这表明采用骨桥接素ASODN选择性抑制肾小球骨桥接素的表达，可阻止肾小球疾病引起的间隙炎症[36]。对糖尿病小鼠连续滴注转化生长因子β(TGFβ)ASODN，可减少肾TGFβ水平，减慢肾脏重量增加并降低胶原蛋白a1(IV) 和纤溶酶mRNA的水平[37]。

　　6 展望

　　目前有很多方法可以达到肾靶向的目的，国外有关肾靶向给药系统的研究很多。但这些研究基本上都停留在临床前的实验室探索阶段，探索到的方法也基本上处于一级靶向(即器官靶向)水平。因此，与肝、肺、脑等其他器官或组织的靶向给药系统相比，肾靶向给药的研究还很初步，亟待完善。肾靶向基因传递技术仍然是不安全不可靠的。随着对肾脏疾病的病理生理学研究的深入，更有效和更具选择性的基因传递技术将会得到发展。对肾病的分子水平的研究必将发展出一种新的技术，从而克服目前基因传递技术的瓶颈。我们期待会不断涌现出新的肾靶向的载体或给药方法，为人类健康服务。

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