软骨素酶ABC促进大鼠脊髓损伤后轴突再生和功能恢复的初步研究

【摘要】 目的 探讨软骨素酶ABC(ChABC)对大鼠脊髓横断损伤(SCI)后轴突再生和功能恢复的影响。方法 SD大鼠随机分为实验组(SCI+ChABC)，对照组(SCI+NS)及正常组。采用T78脊髓完全横断模型，术后2周和10周脊髓标本分别行OBT、GFAP、NSE及NF免疫组化染色，术后1、2、3、4、5、6、8、10周进行行为学评分。结果 行为学评分，术后3周实验组评分高于对照组(P&<0.05)，同时实验组疤痕中OBT和GFAP染色低于对照组(P&<0.05)， GFAP和NF染色高于对照组(P&<0.05)。结论 ChABC能有效降低损伤部位硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)的活性，从而促进SCI大鼠感觉、运动功能的恢复和轴突的再生。

【关键词】 脊髓横断损伤; 软骨素酶ABC; 硫酸软骨素蛋白多糖; 功能恢复; 轴突再生

　　　　【Abstract】 Objective To explore the effects of chondroitinase ABC (ChABC) on the functional recovery and axonal regeneration of transected spinal cord in rats. Methods SD rats were randomly pided into 3 groups: normal group， control group(SCI+NS) and experimental group(SCI+ChABC). The transverse injury models were made beteen the spinal cord of T7 and T8. Immunohistochemistry of OBT， GFAP， NSE and NF were adopted to assess the functional recovery and axonal regeneration in rats at 2 weeks and 10 weeks after operation. Behavioral evaluation was performed at 1， 2， 3， 4， 5， 6， 8 and 10 weeks after operation. Results There was an apparent increase of behavioral scores in experimental group compared with control group at 3 weeks after operation (P&<0.05). OBT and GFAP expression in experimental group decreased significantly than those in control group while NSE and NF expression in experimental group increased significantly than those in control group(P&<0.05). Conclusion ChABC can reduce CSPGs activity at the injury sites. Therefore， it can promote the recovery of motor and sensory function as well as the axonal regeneration.【Key words】 spinal cord transverse injury; chondroitinase ABC; CSPGs; functional recovery; axonal regeneration

　　脊髓损伤(SCI)后功能的恢复受许多因素的影响。目前研究认为，中枢神经系统生长抑制因子对脊髓损伤修复有重要的抑制作用。硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)是疤痕中的重要抑制因子。本试验采用大鼠脊髓横断模型，观察软骨素酶ABC(ChABC)对CSPGs的降解和促进大鼠SCI后功能恢复和轴突再生的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 模型制作80只清洁级雌性SD大鼠(体重200～250 g)在四川省人民医院动物实验室饲养1周后进行模型制作。用氯氨酮腹腔麻醉大鼠(75 mg/kg)，取后正中切口，暴露T78和T910脊髓，在T78用弯刀片完全切断脊髓，并用探针证实。经T910椎板下蛛网膜下腔置入灌注管(PE10导管，外径0.61 mm，内径0.28 mm)至损伤平面并固定，止血，缝合。立即予以灌注1次。待动物苏醒后送动物房分笼喂养，定时排尿(2～3次/日)， 加强护理， 必要时腹腔抗生素注射。40只造模成功的大鼠随机分为实验组和对照组，另取10只未手术大鼠为正常组。实验组：蛛网膜下腔灌注高纯度ChABC 6 μl(10 U/ml)，10 d内隔天经PE管缓慢灌注。对照组灌注生理盐水(NS)6 μl，方法同前。

　　1.2 行为学评分术后1周开始行为学评分并持续到术后10周，本实验采用BBB法(BassoBeattieBresnehan)并结合部分CBS法(combined behavior assessment)指标，正常组评分为53.5分。BBB法是将大鼠放置在1.5 m×2.0 m×1.5 m的桌面上，桌面上铺一薄层一次性治疗巾以增加粗糙度，便于实验大鼠行走，2 min之后开始行为学观察，观察期为5 min，依据BBB评分标准进行评分记录。CBS法的观察指标为：脚趾伸展、触地反应、回缩反射和斜板试验[1]。

　　1.3 组织学观察术后2周、10周分别行脊髓取材。氯胺酮腹腔麻醉，先用灌注泵快速注入370C肝素NS(12 500 U肝素/500 ml NS)200～400 ml，换用4%多聚甲醛(pH7.4，40C)灌注(300～500 ml)。灌注时间约1 h.然后，切开大鼠背部皮肤，仔细取出脊髓(包括损伤平面上下各1 cm)，置入4%多聚甲醛液中固定12 h.脊髓标本行石蜡包埋，横行切片，厚度20 μm.分别行抗硫酸软骨素单克隆抗体(OBT1969)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经中丝蛋白(NF200)免疫组化染色。采用LDP二步法，使用DAKO公司生产的Envision试剂盒，按试剂说明书进行操作。采用BDA呈色，阳性表达为棕黄色。

　　1.4 图像分析每张切片采用Spot图像分析处理系统，高倍镜(×400)下任取5个视野，计数每个视野内染色的阳性面积。

　　1.5 统计学处理采用SSPS 10.0软件分析数据。免疫组化的图像分析数据采用单因素方差分析;BBB评分的统计方法采用两因素方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 行为学评分术后3周左右实验组行为学评分开始有较明显增高。术后2周内实验组与对照组评分无统计学差异(P&>0.05)，术后3周开始两组评分开始有统计学差异(P&<0.05)，第4周提升较快，6周后上升不明显，但与对照组均有统计学差异(P&<0.05)。表1 BBB运动评分

　　2.2 组织学评价OBT免疫组化染色，正常组呈阴性或弱阳性表达，神经细胞清晰可见，形态正常。对照组呈强阳性表达，阳性表达物呈网状、片状分布，神经细胞少见且形态不规则。实验组呈中等或弱阳性表达，神经细胞可见，部分形态正常。实验组阳性染色强度弱于对照组(P&<0.05)，细胞形态、数量优于对照组(图1～3)。GFAP免疫组化染色，胶质细胞(主要为星形胶质细胞)胞浆黄染，轮廓清晰，并有明显的多级突起。正常组：少量散在阳性细胞，多呈扁平的不规则多角形态，星状突起纤细，染色较弱。实验组：阳性细胞中等，突起较短，染色较浅。对照组：阳性细胞数量较多，胞体增大，突起增长呈蜘蛛样，染色增深呈棕褐色。对照组GFAP染色为强阳性，明显强于实验组(P&<0.05)(图4～6)。NF200免疫组化染色，阳性染色光镜下可见损伤区以及其远近端强弱不均的NF200阳性表达，越接近胞体着色越深。实验组则呈中等强度或强阳性表达，以损伤区表达最强。损伤区内再生的神经纤维在长度、数量和密度上优于对照组。实验组NF200阳性染色强于对照组，具统计学意义(P&<0.05)(图7～9)。各组免疫组化阳性染色面积结果见表2.NSE免疫组化染色，正常神经元胞浆和轴突均匀黄染，损伤组织阳性染色细胞减少，着色不均，密度下降，可见脱染。实验组呈中等强度表达，可见中等密度接近正常的神经元、轴突部分着色不均的神经细胞。实验组NSE阳性染色强于对照组，具统计学差异(P&<0.05)(图10～12)。

　　3 讨论

　　近年的研究进展显示：瘢痕中存在抑制轴突再生的分子，这些抑制分子在胶质瘢痕中起主要抑制作用[1]。CSPGs和细胞粘合素(tenascin)是目前发现的疤痕中主要抑制因子，其中前者尤为重要[2]。CSPGs是核心蛋白与硫酸软骨素(CS)链共价交连形成的一类蛋白聚糖，其抑制作用可能和它们的核心蛋白链(GAG链)有关[3]，并通过机械性和化学性两种可能的机理发挥抑制作用[4，5]。在针对胶质瘢痕进行的各种实验性治疗研究中，用酶中和CSPGs的研究最具发展前景[6]。SCI后，损伤区域星性胶质细胞、小胶质细胞以及炎性细胞侵入诱发胶质细胞反应，形成胶质瘢痕。胶质瘢痕在脊髓损伤后修复中起重要作用，同时其形成的致密胶质瘢痕抑制脊髓轴突的再生。现在的研究证明，星形胶质细胞对神经再生的负面效应占优势地位[7]。CSPGs由星性胶质细胞、少突胶质细胞前体、脑脊膜细胞分泌，其中以星性胶质细胞最为重要[8]，是瘢痕中抑制轴突再生的至关重要的分子。 OBT1696特异性地作用于CSPGs，能特异性地反映出脊髓损伤后损伤处CSPGs的沉积情况。GFAP存在于正常星形胶质细胞和反应性胶质细胞中，是星形胶质细胞的分子标记物[9]，主要用于标记损伤后胶质反应。本实验抗OBT1696和抗GFAP免疫组化的结果显示，ChABC能有效降解损伤部位的CSPGs，降低星形胶质细胞反应，从而改善损伤局部的微环境，减少抑制因子的作用，有利于脊髓的再生和功能的恢复。通过行为学评分我们观察到SCI大鼠感觉和后肢运动功能的恢复。实验性脊髓损伤后感觉、运动和反射的变化的评估目前主要采用CBS法和BBB法评分，中和两者的优缺点，我们采用BBB法并结合部分CBS法指标[10，11]，以较准确地反应SCI后每一阶段大鼠脊髓运动功能的恢复情况，正常组评分为53.5分。从本实验可以观察到，2周内实验组和对照组得分没有明显差异，而3周后实验组评分开始明显增高，其感觉、运动和反射等功能也发生明显的恢复，包括排便功能的恢复。NF200能直观地反映神经细胞的功能状态和轴突的再生情况，在损失脊髓轴突再生或神经细胞功能改善时，合成大量的NF200，这时除神经轴突深染外，神经胞体也出现染色。本实验中NF200的阳性表达正反映出神经轴突的再生和神经细胞功能的改善。NSE是烯醇化酶同工酶YY型，它既是神经特异性很高的标记物，同时又是神经元分化的标记物[12]，所以NSE能特异性地反映神经元功能状态。本实验中抗NSE的阳性表达反映了神经细胞功能的改善。同时，实验组大鼠行为学评分的增高与OBT、GFAP等指标相对应，证明ChABC对CSPGs的降解促进了SCI大鼠功能的恢复，而NF、NSE证明了神经细胞功能的改善和轴突的再生，证明其功能的恢复有着解剖学再生的基础。但6周后大鼠功能的恢复相对缓慢，甚至停滞不前，这与目前的研究相一致，即：SCI后的治疗应该是一个综合的工程，抑制因子的种类也在不断被发现，多因素联合治疗的疗效应好于单因素[13]。

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