【摘要】 目的 建立盐炙胡芦巴的指纹图谱测定方法，并对4个产地10批胡芦巴的生品和盐炙品进行对比实验，为胡芦巴饮片的质量控制提供可靠的方法。方法 采用HPLC法，色谱条件为：DiamonsilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱;流动相：乙腈水梯度洗脱;检测波长：211 nm;流速：1.0 ml/min;柱温：35 ℃;进样量：20 μl。结果 在相应的色谱条件下，胡芦巴生品和盐炙品的指纹图谱比较：盐炙品较生品少5个共有峰。结论 胡芦巴盐炙前后化学成分的种类或含量变化较大。
【关键词】 胡芦巴; 盐炙; 指纹图谱
【Abstract】 Objective To establish a HPLC method for determination of fingerprints of semen trigonellae stirheated with salt solution，and to provide a reliable method for the quality control of this crude drug. Methods The separation was performed at a Rp C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column using acetonitrile and water as the mobile phase. The detection wavelength was 211 nm. The mobile phase consisted of acetonitilewater at the flow rate of 1.0 ml/min. The temperature of column was 35 ℃. The injection volume was 20 μl. Results At the same condition，fingerprints of semen trigonellae stirheated with salt solution was 5 common peaks less than those without salt solution. Conclusion The type or content of semen trigonellae appears to change greatly before and after stirheated salt solution.【Key words】 semen trigonellae; stirheated with salt solution; fingerprints
胡芦巴为豆科一年生草本植物胡芦巴Trigonella foenumgraecum L.的干燥成熟种子[1]。主要分布于地中海东岸、中东、伊朗高原及喜玛拉雅地区。在我国南北各地均有栽培，在西南、西北呈半野生状态，主产于河南商丘、甘肃天水、四川广元、金堂及安徽亳州，分布于东北、西南及河北、陕西、甘肃、新疆、山东、江苏、安徽、浙江、河南、湖北、广西等地。《中国药典》2005年版一部收载了生品和盐炙品：生品具有温助肾阳，祛寒，止痛的功效，用于肾阳不足，寒邪凝滞下焦的小肠疝气疼痛、腹胁胀满、腰痛、脚气疼痛及下元虚冷的阳痿、遗精、尿频等病证;盐胡芦巴可引药入肾，温补肾阳力专，常用于疝气疼痛，肾虚腰痛，阳痿遗精等症[24]。本研究主要对胡芦巴盐炙前后指纹图谱进行对比实验，以期为下一步的质量标准研究打下基础。
1 仪器与试剂
Varian prostar210(分析型)高效液相色谱仪(美国瓦里安);DiamonsilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱(北京迪马科技);KUUDOS SK250HP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);BP211D AG电子天平(德国Sartorius);正德牌远红外可控温电炉(功率45～2 000 W);红外测温仪(smart仪器有限公司)，炒锅，SH/T0093沙芯过滤装置(建湖县长城仪器制造有限公司)等。
1.2 试剂甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
1.3 试药
1.3.1 胡芦巴 经成都中医药大学中药标本中心卢先明教授鉴定，均为豆科植物胡芦巴Trigonella foenumgraecum L.的干燥成熟种子。夏季果实成熟时采割植株，晒干，打下种子，除去杂质。符合《中国药典》2005年版一部167页胡芦巴药材项下有关规定。药材来源与购买地信息具体(见表1)。表1 胡芦巴HPLC指纹图谱研究药材样品
1.3.2 盐胡芦巴 取净胡芦巴饮片1 kg，加规定量的盐水400 ml拌匀后，置密闭的容器内闷润2 h，置设定的温度200 ℃下炒炙炒约35 min，每分钟翻炒30次，取出，放凉。每100 kg药材用食盐2 kg.
2 方法学研究
2.1 色谱条件与系统适应性实验
2.1.1 色谱条件色谱柱 DiamonsilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱;流动相：乙腈水与乙腈的比例，0～25 min为10%～21%，25～60 min为21%～34%，60 min停止。检测波长：211 nm;流速：1.0 ml/min;柱温：35 ℃;进样量：20 μl.
2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取胡芦巴(盐胡芦巴)粉末1 g，分别置于50 ml具塞三角瓶中，分别加入10 ml 70%甲醇，密塞，称定重量，超声提取30 min，放冷，称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液3 ml，置10 ml容量瓶中，用70%甲醇定容，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度考察 取同一供试品(1号样品)溶液，连续进样5次，以考察仪器的精密度。测得各共有峰的峰面积的RSD小于3%，结果表明仪器和整个系统的精密度良好。
2.2.2 稳定性考察 取同一份供试品(1号样品)溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h这5个时间点进行检测，以考察样品的稳定性。测得各共有峰的峰面积的RSD小于3%，结果表明供试品在12 h内稳定性良好。
2.2.3 重复性考察 取同一批号(1号样品)的供试品5份，按照供试品溶液的制备和检测方法进行检测，测得各共有峰的峰面积的RSD小于3%，结果表明本方法的重现性良好。
2.3 样品测定
2.3.1 胡芦巴生品HPLC指纹图谱测定[5] 生品胡芦巴共有10个样，对应的高效液相图谱叠加图见图1.
2.3.2 胡芦巴盐炙品HPLC指纹图谱测定 盐胡芦巴共有10个样品，对应的高效液相图谱叠加图见图2.
2.3.3 相似度评价 将所得HPLC指纹普图，选取1号样品作为代表性样品，以其色谱作为代表性指纹图谱，其他样品与之比较，将其原始测试数据输入指纹图谱相似度评价软件中经计算产生的相似度。胡芦巴生品相似度评价结果见表2，胡芦巴盐炙品相似度评价结果见表3.表2 10批胡芦巴生品相似度评价结果表3 10批胡芦巴盐炙品相似度评价结果可见大部分样品图谱的共性特征基本吻合，相互之间的相似度较高，均在0.90以上，符合《中药注射剂指纹图谱技术指南》要求(0.9～1.0)。
3 讨论
在供试品溶液的制备方面，笔者对提取溶剂、提取方法、提取时间、提取次数分别都进行了考察，结果表明：采用70%甲醇超声提取1次，提取时间为30 min的提取效果为最佳。在色谱条件的选择方面，分别对色谱柱、流动相、流速、柱温、检测波长进行了考察，最后确定了相应的条件，色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：乙腈水梯度洗脱;流速：1.0 ml/min;柱温：35 ℃;检测波长：211 nm.通过对以上10批胡芦巴样品盐炙前后的研究，建立了初步的指纹图谱测定方法，对于盐炙胡芦巴的研究奠定了一定的基础。在实验过程中，盐胡芦巴在与生品相应的色谱条件下出现的峰信息比较少，可能和工艺研究过程中的温度影响有关，使其中的化学成分种类或含量产生变化;或是指纹图谱条件只适用于生品，而不适用于盐制品。但是由于时间关系等未对其他来源产地的胡芦巴做相关全面研究，为了对质量标准进行完善和规范，还需要进一步的研究。
参考文献
1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版一部[M].北京：化学工业出版社，2005:167.
[2] 龚千锋.中药炮制学[M].北京：中国中医药出版社，2003:98.
[3] 周淑晶.中药胡芦巴的化学成分研究进展[J].中药研究与信息，2000，2(5):1922.
[4] 国家中医药管理局中化本草编委会.中华本草[M].上海:上海科技出版社，1999:3421.
[5] 潘娟，赵陆华，陈林霖，等.胡芦巴药材HPLC指纹图谱的初步研究[J].中国药学杂志，2006，41(5):335337.doi:10.3969/j.issn.16742257.2009.03.013