二苯乙烯苷对Aβ2535致NG10815损伤的保护作用

　　　　　　 作者：黄忠仕，农嵩，谢海渊，张树球，李韬，李曙波

【摘要】 　　目的 观察二苯乙烯苷对Aβ2535诱导损伤的NG10815细胞生长、分化的影响。方法 以Aβ2535诱导NG10815细胞建立痴呆细胞模型后加入二苯乙烯苷培养，观察NG10815细胞的生长状态、存活率、突起率及突起平均长度。结果 与细胞模型组相比，二苯乙烯苷组能在一定程度上抑制Aβ2535对痴呆细胞的损伤作用，细胞生长状态良好，细胞存活率、突起率及突起平均长度与模型组比较均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。结论 二苯乙烯苷对Aβ2535诱导的NG10815细胞损伤具有保护作用。

【关键词】 二苯乙烯苷 老年性痴呆 β淀粉样蛋白 NG108 15细胞

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of TSG on the growth and differentiation of NG10815 cells which were injured by Aβ2535.Methods NG10815 cells were cultured by Aβ2535 to establish cell model of Alzheimer's disease (AD) and then were cultured with TSG. The growth state，survival rate，neurite outgrowth and average length of outgrowth of NG10815 cells were observed.Results TSG could protect NG10815 cells from Aβ2535 damage. Compared with model group，the morphology， survival rate， neurite outgrowth and average length of outgrowth of NG10815 cells were significant difference from TSG group (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion TSG can protect the NG10815 cellular injury induced by Aβ2535.

　　【Key words】 2，3，5，4’tetrahydroxystilbene2OβDglycoside (TSG); Alzheimer's disease (AD);βAmyloid protein;NG10815 cells

　　二苯乙烯苷（2，3，5，4’四羟基二苯乙烯βD葡萄糖苷，TSG）是何首乌中的主要水溶性成分。近年来发现二苯乙烯苷对神经具有保护作用，其作用机制可能通过钙通道拮抗、抗氧化、胆碱脂酶抑制剂、调节细胞凋亡等途径而起作用的，因此对老年性痴呆（Alzheimer’s disease，AD）等神经退行性病变的防治具有很好的应用价值，可开发研制为治疗老年性痴呆的新药物［1～3］。本实验以Aβ2535诱导NG10815细胞建立痴呆细胞模型，并观察二苯乙烯苷对该模型的影响，现报道如下。

　　材料和方法　　

　　1.实验材料

　　①实验细胞株：NG10815细胞由广西中医学院钟振国教授惠赠。②试剂与仪器：主要试剂有二苯乙烯苷（由本教研室根据有关文献［4］提取）；Aβ2535片段，cAMP，Penicillin G，硫酸链霉素，MTT（以上试剂由Sigma公司提供）；HAT（次黄嘌呤/胸腺嘧啶核苷/氨甲喋呤）（Gibco 公司提供）；胎牛血清（FBS），DMEM培养基（Hyclone公司提供）。主要仪器为CO2培养箱（Thermo Forma公司）；倒置显微镜（南京江南光电股份有限公司）；酶标仪（Metertech公司）。

　　2.培养方法

　　将细胞培养分为三组，①正常对照组：以5&ûS培养，不加Aβ2535；②模型组：以5&ûS培养，加Aβ2535；③TSG组：以5&ûS培养，加TSG（25、50、100 μmol/L）+Aβ2535。细胞增殖培养时，将NG10815细胞加入细胞增殖液（5&ûS+DMEM+1%HAT+1%双抗）悬浮细胞，离心，去上清液，分装至50 ml培养瓶，10%CO2、37℃培养。待细胞基本长满后，用细胞增殖液将细胞数稀释至约3万/ml，传到96孔培养板，每孔150 μl。继续培养1天后，去掉原培养液，更新增殖液，同时模型组、TSG组每孔加入Aβ2535至终浓度为5μΜ，继续培养48小时。将上述在50 ml培养瓶中长满的NG10815细胞用细胞分化液（5&ûS+1%HAT+1%双抗+1 mMcAMP+DMEM）稀释至约3万/ml，按每孔150 μl传到96孔培养板培养。分化液培养，同时模型组、TSG组每孔加入Aβ2535至终浓度为5 μΜ，继续培养48小时。

　　3.观察指标

　　①细胞形态学观察：每天用倒置显微镜对96孔培养板上各组细胞进行观察及拍照。②增殖或分化细胞存活率的检测：用MTT法对增殖或分化培养48小时后的细胞进行检测，可分别得到与以上两类细胞存活率相对应的OD值。吸弃待测细胞培养孔内培养液，加无血清DMEM液100 μl/孔，MTT液20 μl，于37℃、10%CO2条件下4小时，出现兰色结晶后，加SDSDMF100 μl/孔，于37℃、10%CO2条件下过夜，用酶标仪于λ=570 nm测OD值。③分化细胞突起率及其平均长度：置分化培养48小时后的分化细胞于倒置显微镜下，在培养板每孔上下左右中5个视野各拍片一张，然后在照片上测量轴突的长度和计算突起细胞的百分比，当细胞突起长度超过细胞的直径时为突起阳性细胞。

　　4.统计学方法

　　所有检测结果以均数±标准差（-±s）表示，采用SPSS11.0统计软件分析，组间均数比较采用t检验，显著性水平设在α=0.05。

　　结 果　　

　　1.细胞形态学观察结果 以含cAMP分化剂的培养液培养的细胞为分化相，不含cAMP的为增殖相。增殖相细胞的形态观察结果显示：对照组、TSG组细胞增长良好，胞浆均匀透亮，周围呈绒毛状及有短突起，细胞表面无明显斑点及沉积物；模型组细胞数量明显减少，胞浆较暗淡，有斑点、空泡，部分细胞变黑、聚集及死亡。分化相细胞的形态观察结果显示，各组细胞有较长的细胞突起，TSG组突起较模型组长，胞浆均匀透亮，模型组部分细胞有斑点，变黑或死亡。（见图1～6）。

　　2.各组增殖细胞存活率的比较
　　
　　不加Aβ2535的正常对照组增殖最快，OD值最高；模型组增殖最慢，OD值最低。各组与正常对照组比较均有显著性差异（P＜0.01）；TSG各剂量组与模型组比较具有高度显著性差异(P＜0.01)。见表1。表1 TSG对NG10815增殖细胞存活率的影响(略)注：与正常对照组比较：※P＜0.05，※※P＜0.01；与模型组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

　　3.各组分化细胞存活率的比较

　　在分化剂cAMP的作用下，NG10815细胞将停止增殖而成为分化细胞，不含Aβ2535的正常对照组与原代播下的细胞数基本相同，可设其存活率为100%，实验结果显示含Aβ2535的各组细胞数均低于正常对照组。经组间t检验，TSG组的OD值与正常对照组比较具有高度显著性差异（P＜0.01），与模型组比较亦具有高度显著性差异(P＜0.01)。TSG各剂量组均能提高NG10815分化细胞的存活率。见表2。表2 TSG对NG10815分化细胞存活率的影响(略)

　　4.各组分化细胞的细胞突起率及突起平均长度比较

　　在分化剂cAMP的作用下，NG10815细胞将分化成为具有较长突起的分化细胞。各组细胞突起率中以不加Aβ2535的正常对照组最高。经组间t检验，TSG低、中剂量组的细胞突起率与正常对照组比较具有高度显著性差异（P＜0.01），TSG各组与模型组比较具有高度显著性差异(P＜0.01)。各组细胞突起平均长度比较，模型组明显短于其它组(P＜0.01)，TSG组与模型组比较，差异具有高度显著性(P＜0.01)。见表3。表3 各组分化突起细胞占总细胞数的比率及突起平均长度比较（略）

　　讨 论　　

　　AD是一种原发性大脑神经退行性病变，为特有的中枢胆碱能神经元的大量死亡及丢失，伴有老年斑（SP）、神经纤维缠结（NFT）的形成、胆碱能神经细胞的损害、胆碱乙酰基转移酶（ChAT）水平下降和乙酰胆碱（Ach）递质合成的降低、突触蛋白I（Synapsin Ⅰ）水平下降、乙酰胆碱递质释放减少等特征［5～7］。NG10815细胞株为神经肿瘤细胞，由小鼠的神经胚胎母细胞瘤（Neuroblastoma，不能合成Ach）与大白鼠神经胶质细胞瘤（Glioma，能合成Ach，但不能释放）细胞杂交融合而成。这种杂交细胞能无限地继代繁殖，能合成并释放乙酰胆碱递质，具有神经细胞的突起以及正常神经细胞所具有的离子通道及酶等［8～10］。因此，具有胆碱能特性的NG10815细胞作为神经细胞模型，能较好地模拟AD的病理改变。Aβ是AD病患者大脑组织中老年斑的主要成分，它的活性部位在第25到35个的11个氨基酸片段。在NG10815细胞加入Aβ2535片段，可使细胞的形态学、死亡率、ChAT活性水平、SynapsinⅠ水平、Ach递质释放能力等与AD病理生理变化基本一致，因此，可用Aβ2535片段诱导NG10815神经细胞建立AD细胞模型［11～12］。

　　本实验结果显示：经5 μM Aβ2535作用48小时后，NG10815细胞形态结构及生长分化情况较正常培养的细胞发生了明显的变化。无论是增殖相还是分化相，细胞数量都明显减少，可见死亡、变黑、碎裂细胞；分化细胞的突起率降低，细胞突起平均长度也明显减少，表明Aβ2535片段可损伤体外培养的NG10815细胞，抑制细胞的生长和分化，并进一步诱导细胞死亡，而二苯乙烯苷组细胞增长良好，细胞透亮、均匀，表面无明显斑点及沉积物，细胞存活率、细胞突起率及细胞突起平均长度与模型组比较，均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），表明二苯乙烯苷能在一定程度上抑制Aβ2535对细胞的损伤作用。有关其详细的保护作用机制，仍需通过进一步实验加以证实。

参考文献

　　［1］王 巍，王丹巧.何首乌脑保护作用机理研究的进展［J］. 中国西医结合">中西医结合杂志，2005，25(10)：955-959.

　　［2］王春英.何首乌中有效成分二苯乙烯苷的研究进展［J］. 河北医科大学学报，2008，29（1）：157-160.

　　［3］贾 新，陈建宗.二苯乙烯苷神经保护作用及其机制的研究进展［J］. 国际中医中药杂志，2007，29（6）：347-48.

　　［4］朱海升，蔡光明，刘鄂湖，等.大孔吸附树脂分离纯化何首乌有效成分二苯乙烯苷的研究［J］. 解放军药学学报，2006，22（4）：269-273.

　　［5］Pedersen WA，Kloczewiak MA，Blusztajin JK.Amyliod βprotein reduces acetylcholine synthesis in a cell line derived from cholinergic neurouns of the basal forebrain［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:8068-8071.

　　［6］Masliah E，Terry R.The role of synaptic protein in the pathogenesis of disorders of the central nervous system［J］. Brain Pathology， 1993， 3(1): 77-85.

　　［7］周永球，吴文峰.百年乐治疗老年血管性痴呆的疗效观察［J］. 右江医学，1996，24（1）：15-16.

　　［8］Li MF，Shi YL.The longterm effect of toosendanin on current through nifedipinesensitive Ca2+ channels in NG10815 cells［J］. Toxicon，2005，45(1): 53-60.

　　［9］Hu Q，Shi YL.Characterization of an inwardrectifying potassium current in NG10815 neuroblastoma×glioma cells［J］.Pfluger's Arch， 1997，433(5): 617-625.

　　［10］Xu TH，Ding J，Shi YL.Toosendanin increases freeCa2+ concentration in NG10815 cells via Ltype Ca2+ channels［J］. Acta Pharmacol Sin，2004， 25(5): 597-601.

　　［11］Sara M，Lippa，Carol F.et al.Synuclein aggregation in pathological aging and Alzheimer's disease: The impact of βamyloid plaque level ［J］. American Journal of Alzheimer's Disease and Other Dementias，2005;20: 315-318.

　　［12］钟振国.由Aβ2535片段神经毒性诱导NG10815细胞建立老年性痴呆细胞模型的探讨［J］. 中华临床医药，2002，3(24):18-20.