妊娠期高血压疾病患者胱硫醚β合酶基因突变频率分析

　　　　　　 作者：覃红萍，赵权英，李金平

【摘要】 目的 初步探讨同型半胱氨酸（Hcy）代谢相关酶胱硫醚β合酶(CBS)基因C572T基因突变频率在广西河池地区妊娠期高血压疾病(HDP)发病中的作用。 方法 采用等位基因特异性扩增(ASA)技术检测63例HDP患者（观察组）和32例孕期经过顺利的正常孕妇(对照组)CBS基因 C572T基因型。结果 HDP组CBS基因C572T T/T、C/T和C/C基因型频率分别为4.76%、84.13%和11.11%;对照组分别为3.13%、87.50%和9.37%;HDP组C等位基因频率为53.17%、T等位基因频率为46.83%，对照组分别为53.13%和46.87%，二者比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 CBS C572T基因突变频率与HDP发病无明显相关性，其基因突变频率可能不足以构成广西河池地区HDP发病的独立遗传危险因素。

【关键词】 妊娠期高血压疾病;胱硫醚β合酶;同型半胱氨酸;基因频率

　　【Abstract】Objective To study the effect of mutation frequency of cystathionine βsynthase(CBS) in patients with hypertensive disorder complication pregnancy(HDP).Methods 63 patients with HDP and 32 healthy pregnant women were pided into HDP group and control group. their C572T genotypes were detected by the technique of Allelespecific amplification (ASA).Results The frequency of CBS gene type T/T，C/T and C/C were 4.76%，84.13% and 11.11% respectively in HDP group，while the control group were 3.13%， 87.50%，9.37% respectively. The frequency of C alleles and T alleles were 53.17% and 46.83% in HDP group，while the control group were 53.13% and 46.87%.there was no significant difference between the two groups(P＞0.05). Conclusion There was not significant correlation between C572T and hypertensive disorder complication pregnancy，its mutation frequency may not be independent risk factor for hypertensive disorder complication in He Chi population.

　　【Key words】 Hypertensive disorder complication pregnancy;Cystathionine βsynthase；Homocysteine；gene frequency

　　妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorder complication pregnancy，HDP)是威胁孕产妇健康的重要疾病，与产后出血、感染、妊娠合并心脏病一起构成孕产妇死亡的四大原因，其发病率为7%～10%，是导致孕产妇和围生儿发病率和死亡率增高的重要原因［1］。HDP的发病机制至今尚未完全阐明，临床观察发现其发生率在有HDP家族史的妇女明显高于无家族史者，认为遗传因素在HDP发病中有重要作用。近年来的研究认为HDP的发病与高同型半胱氨酸血症（Hyperhomocyseinemia，HHcy）存在相关性［2，3］。胱硫醚β合酶(Cystathionine βsynthase，CBS)为同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）代谢途径中的关键酶，其编码基因CBS基因突变可引起该酶活性的改变，从而影响Hcy代谢。本课题通过对广西河池地区HDP患者CBS基因突变频率检测，探讨其在HDP发病机制中的作用。

　　资料和方法

　　1.研究对象

　　选取2007年5月至2008年9月在我院定期产前检查并住院分娩的HDP患者63例（观察组），其中妊娠期高血压18例， 轻度子痫前期30例，重度子痫前期15例，诊断及分类标准参照乐杰主编的《妇产科学》第6版，孕妇年龄20～37岁，平均年龄24岁，孕周32～40周，平均37周。同时随机选取同期来我院住院分娩的、无妊娠并发症及合并症、孕期经过顺利的正常孕妇32例作为对照组，年龄22～35岁，平均25岁，孕周33～40周，平均36周。所有孕妇均为广西河池地区人氏，均无原发性高血压、糖尿病、慢性肾炎、心脏病等病史， 各组孕妇年龄及孕周比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

　　2.研究方法

　　（1）标本的采集和处理

　　受试者清晨空腹抽取外周静脉血4 ml，2%EDTA抗凝，3000 r/min离心5 min，分离白细胞后采用酚/氯仿法提取人基因组DNA，并用8 g/L琼脂糖凝胶电泳检查基因组的完整性，紫外分光光度计检测DNA含量和纯度。

　　（2）CBS C572T基因型检测

　　采用等位基因特异性扩增（ASA）技术检测CBS 基因型。PCR反应试剂购于TaKaRa公司，琼脂糖为Biowest Agarose，溴化乙锭购于华美生物工程公司，凝胶成像系统及QuantityOne软件、PCR仪为Biorad公司。PCR引物反应体系及程序:野生正向引物(DNA位置6696～6714):5′GGG CTGAGA TTG TGAGGA C3′，突变正向引物:5′GGG CTG AGA TTG TGA GGA T3′， 反向引物(DNA位置7030～7045):5′ACA CTC CCA GGC AGC C3′，由上海生工合成。产物大小350 bp。PCR反应体系50 μl，包括DNA模板0.2 μg，10 μmol/L dNTPS1 μl，10 μmol/L引物各2 μl，10×PCR缓冲液5 μl，Taq聚合酶1.25/U，25 mMol/L MgCl 23 μl。PCR反应扩增程序:95℃预变性2 min，然后95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，共35个循环，最后延伸72℃ 7 min。将PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶， 80 V电压下电泳35 min，溴化已锭染色，以DL2000为DNAMarker，凝胶成像系统观察带型并照相。

　　3.统计学方法

　　用SPSS11.5软件包处理数据。计量资料以均数±标准差（-±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，并计算比值比(Odds Ratio，OR)及95%的可信区间(CI)，以此估计基因突变频率对疾病发生的相关危险度。检测水平取双侧0.05，P＜0.05表示有统计学意义。

　　结 果　　

　　1.基因型的确定

　　扩增产物大小为350 bp，产生三种基因型:野生型C/C、杂合突变型C/T和纯合突变型T/T，见图1。

　　 2.基因突变频率分析

　　HDP组基因型C/C、C/T、T/T和T等位基因频率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。C/T型对HDP组OR为0.76(95%CI为0.22～2.63)，T/T型对 HDP组OR为1.55(95%CI为0.16～15.53)，提示C572T与HDP无明显相关性。
表1 两组C572T基因突变频率及等位基因频率分布例数（略）注： ★与对照组基因型频率及等位基因频率比较，P＞0.05

　　讨 论　　

　　高同型半胱氨酸血症(HHcy)作为心血管疾病的一个独立危险因素近年来已得到广泛的认可。同时，HDP与HHcy发病的相关性研究近年来也见诸多报道［2～4］，兼有HHcy血症孕妇发生HDP的危险度是非HHcy血症孕妇的7.7倍，妊娠期Hcy水平可作为早期预测和诊断妊娠期高血压疾病的重要指标［4～6］。

　　胱硫醚β合酶（CBS）是体内Hcy转硫代谢途径的关键酶。在以吡哆醛磷酸(pyidoxalphosphate，PLP)为辅酶参与下，CBS催化β置换反应，使Hcy与丝氨酸缩合生成胱硫醚，后者在胱硫醚γ酶作用下进一步转变成半胱氨酸和α丁酮酸。体内约53%的Hcy被CBS和胱硫醚γ酶不可逆转化为半胱氨酸，可见CBS在维持Hcy正常代谢，避免血浆Hcy异常升高方面起重要作用。人CBS基因定位于21号染色体靠近端粒的位置，全长25～30 kbp，包含23个外显子，编码CBS多肽的551个氨基酸残基。在目前已知的CBS基因132个突变位点中，大多数为错义突变和缺失突变，不同的突变位点对CBS活性的影响不尽相同。C572T位点位于编码区第5外显子(EX5)，cDNA的第572位(基因组第6714位)C被T替代，使第191位密码原编码的苏氨酸(T)变为蛋氨酸(M)，导致酶活性严重下降，引起Hcy代谢障碍、进而可形成HHcy血症。哥伦比亚HHcy血症患者C572TT等位基因突变频率高达75%，在西班牙和葡萄牙约为50%，而在南美委内瑞拉、阿根廷和巴西分别为25%、20%和14%［7～9］。李丽帆等［10］研究发现C572T中T等位基因频率在广西籍冠心病患者为48.44%，在正常人为46.67%，二者差异无统计学意义(P＞0.05）。目前尚未见C572T与HDP的相关性研究报道。本研究中，观察组基因型T/T、C/T型及T等位基因频率分别为4.76%、84.13%和46.83%，而对照组分别为3.13%、87.50%和46.87%，两组基因型及等位基因频率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），提示C572T与HDP发病无明显相关性；C/T、T/T型OR小于或略大于1.0，提示CBS C572T可能不足以构成广西河池地区HDP发病的独立遗传危险因素。HDP为多因素、多基因参与形成的疾病，单纯从CBS某个或某几个突变位点来确定其对HDP的作用，其意义往往很有限，况且研究本身受样本量和基因位点代表性的限制。因此，要全面阐述CBS基因多态性与HDP的关系，需进一步增加样本及多基因、多位点、多因素的综合研究。

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　　［10］李丽帆，李金平，顾国龙.冠心病患者胱硫醚β合酶基因C572T多态性频率检测及临床意义［J］.山东医药，2008，48(2):1-2.