作者：范婕 史威 张林西 李海军 金春亭 武欣 郭颖
【摘要】 目的：探讨 Ezrin在乳腺癌中的表达特点及其与临床病理参数的关系。方法：应用免疫组织化学S-P法检测62例乳腺癌组织中Ezrin的表达情况。结果：Ezrin异常阳性表达率在乳腺导管内癌、浸润性导管癌中分别为30%、75%，差异有统计学意义(P&<0.05)。在乳腺癌中，Ezrin异常表达与临床TNM分期、腋淋巴结转移呈正相关(P&<0.05)，而与患者年龄、发生部位无关(P&>0.05)。结论：Ezrin表达水平提高提示癌组织具有更高的浸润、侵袭能力和淋巴结转移风险，检测 Ezrin有望成为判断乳腺癌患者预后的新指标或治疗肿瘤转移的一个靶点。
【关键词】 乳腺肿瘤；Ezrin；肿瘤转移；免疫组织化学
【ABSTRACT】 Objective:To investigate the expression of Ezrin in human breast cancer，and study its expression and clinical significance in breast cancer.Methods:The expressions of Ezrin in all specimens were detected by SP immunohistochemistry.Statistical analysis of the results was performed using SPSS 15.0 for windows statistical package.Results:The abnomal positive expressing rates of Ezrin in groups of intraductal carcinoma and invasive ductal carcinoma were separately 30% and 75%，the differences had significant statistical significance(P&<0.05).The overexpression of Ezrin in breast carcinoma had some relationship with the clinical TNM staging and axillary lymph nodes metastasis(P&<0.05)，but had no relationship with age and location(P&>0.05).Conclusion:High expression level of ezrin in breast cancer suggests more aggressive and higher risk of lymph node metastasis.Ezrin may be an indicator in judging prognosis of breast cancer.The results may lead to development of a therapeutic modality in future clinic.
【KEY WORDS】 Breast Neoplasms，Ezrin，Neoplasm Metastasis，Immunohistochemistry
乳腺癌是威胁妇女健康和生命的常见恶性肿瘤之一。近年来，我国的乳腺癌发病率一直呈上升趋势。肿瘤的浸润与转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是导致肿瘤患者治疗失败及患者死亡的主要原因。因此，研究乳腺癌浸润和转移，探讨乳腺癌的相关预后因素具有重要的临床意义。Ezrin为膜细胞骨架连接蛋白（memberance cytoskeleton cross linker protein），是一个82kDa的磷酸化蛋白，其编码基因为Villin2，定位于染色体6q25.2-q26[1]。Ezrin是最近发现的一个崭新的肿瘤转移相关基因。Ezrin的过量表达已被证实与多种肿瘤的转移有关[2，3]。本研究采用免疫组化S-P法检测Ezrin的表达，以探讨其在乳腺癌中表达的意义及其与乳腺癌临床病理学特征的关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集河北北方学院病理教研室 2002-01—2004-04月期间存档的乳腺癌术后送检标本共计62例，均为女性，年龄25～73岁，平均年龄50.89岁。所有病例术前均未行放、化疗，其中临床分期Ⅰ期16例，Ⅱ期31例，Ⅲ+Ⅳ期15例；有腋淋巴结转移病例25例，无腋淋巴结转移病例 37例。所有病例临床资料完整，标本均经10%中性福尔马林固定，常规处理后石蜡包埋，连续切片，厚4μm，HE染色，由2位资深病理医师重新光镜下观察确诊。
1.2 试剂与方法
Ezrin鼠抗人单克隆抗体（克隆号：3C12），工作液浓度1∶50，购自Lab Vision Neomarker公司，S-P试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡切片经脱蜡、梯度水化后，置10mmol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)中，热平台修复抗原，使温度保持在98℃以上持续12min，自然冷却至室温。3%过氧化氢室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。正常山羊血清封闭非特异性抗原30min后，吸去多余血清，滴加小鼠抗人Ezrin单克隆抗体，4℃放置过夜。枸橼酸盐缓冲液（PBS）洗5min×3次后，滴加生物素化二抗，37℃放置30min；PBS洗5m in×3次后，滴加S-P，37℃放置30min。DAB显色；苏木素复染；中性树脂封片。以肺组织阳性切片作为Ezrin阳性对照，以PBS替代一抗作为阴性对照。
1.3 评定标准
Ezrin阳性表达在细胞膜和细胞浆内，呈棕黄色颗粒，按染色强度和阳性表达细胞数比例，参考 Li等的分级标准[4]：-，无表达；+，&<50%细胞阳性表达或染色较浅；++，≥50%细胞阳性表达且深染。++为异常阳性表达。
1.4 统计学处理
试验数据采用 SPSS15.0进行统计学分析：χ2检验将各组试验结果进行统计学分析，当P&<0.05认为差异具有显著性。
2 结果
Ezrin表达阳性多表现在癌细胞的胞浆中出现棕黄色颗粒，呈灶性或弥漫分布，大小不一，着色轻重不同，部分病例癌细胞细胞膜上也有表达。核膜均未见着色，细胞核被苏木素染为蓝色。62例乳腺癌组织中，有42例Ezrin异常表达，异常表达率为67.7%。≤50岁组Ezrin异常表达率为63.6%低于&>50岁组异常表达率72.4%，差异无统计学意义(χ2=0.54 P=0.588)。右乳异常阳性率高于左乳异常阳性率，但差异无显著性(P=0.788)。乳腺导管内癌组Ezrin异常阳性率(30%)与浸润性导管癌组(75%)比较，差异具有统计学意义(χ2=7.77，P=0.009)，提示乳腺导管内癌进展为浸润性导管癌时Ezrin发挥作用。在不同临床TNM分期组中异常阳性表达率不同，差异均有统计学意义(χ2=6.82 P=0.033)。同时，Ezrin异常表达与腋淋巴结转移有关(χ2 =5.06，P=0.029)(见表1)。表 1 Ezrin表达与乳腺癌临床病理特征的关系
3 讨论
肿瘤细胞的侵袭和转移一般分为三个步骤：粘附改变、基质降解和迁移。细胞的迁移需要极性化、伸展、粘附、去粘附和退缩等复杂事件的协调配合。许多蛋白质参与细胞迁移的调节。Ezrin为膜细胞骨架连接蛋白，是连接细胞膜和细胞骨架之间的ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成员之一。Ezrin可表达于各型上皮细胞及某些非上皮细胞，在不同组织与细胞的表达提示着Ezrin有着广泛的生理功能。它在细胞中有两种存在状态：当Ezrin自身的N端和C端相互作用而使蛋白处于折叠状态，此时它为休眠状态。在某些因素的作用下，其梭基端一关键的与其激活有关的磷酸化位点被磷酸化，使蛋白展开而同胞膜和细胞骨架发生作用，此时处于激活状态。最初简单的认为ERM只起到连接细胞膜蛋白和肌动蛋白的功能，后来发现其参与许多重要的细胞复合体和特化的细胞表面结构域的形成，以及分子在此结构上的定位。近年来研究发现Ezrin在肿瘤细胞转移过程中扮演重要角色。很多类型的肿瘤中都有Ezrin的异常表达[3，5，6]。其通过改变肿瘤细胞极性及细胞运动、调节肿瘤细胞间粘附及细胞与细胞外基质粘附、参与肿瘤细胞内信号转导，从而在肿瘤发展、浸润和转移过程中发挥重要作用。
Yu等[7] 及Khanna等[8]在两个独立研究均采用了基因芯片这种最新的大通量筛查差异基因表达的方法对两种肿瘤（横纹肌肉瘤和骨肉瘤）高转移性和低转移性变异细胞株的研究。发现Ezrin在转移的细胞克隆中都过量表达。将全长Villin2基因转染至低转移细胞株能明显增强细胞的肺转移能力。说明Ezrin的过表达有助于肿瘤的转移。更重要的是，应用Ezrin显性负性变异体，反义RNA或DNA干扰的实验研究，证实Ezrin的过表达不仅是肿瘤转移进展的充分条件，而且也是其必要条件。对多种实体瘤的研究[9，10]发现，伴有淋巴结转移的癌组织中Ezrin高表达，而不伴有淋巴结转移者则低表达，并且其表达与患者的预后明显相关。本试验对手术切除的人乳腺癌组织应用免疫组化的方法检测Ezrin的表达，结果表明Ezrin在乳腺浸润性导管癌细胞中异常表达，表达率（75%）明显高于导管内癌组织（30%），二者差别有统计学意义，提示乳腺导管内癌进展为浸润性导管癌时，Ezrin发挥作用。Ezrin异常表达与乳腺癌 TNM分期也密切相关（χ2 =6.82，P=0.033）(r=0.326，P=0.01)，在Ⅰ期样本中，只有43.8%(7/16)出现Ezrin异常表达，在Ⅱ期样本中，则有 71.0%(22/31)出现Ezrin异常表达，而在Ⅲ+Ⅳ期样本中，有高达 86.7%(13/15)出现Ezrin异常表达。更有意义的是，Ezrin表达与肿瘤的淋巴结转移密切相关。从本组数据可以看出，有淋巴结转移的一组乳腺癌组织中Ezrin异常表达率（84%）明显高于无淋巴结转移组（56.7%），（χ2 =5.06，P=0.029）两者差别有统计学意义，提示Ezrin的异常表达预示着乳腺癌患者有较高的淋巴结转移率，而淋巴结转移是影响乳腺癌患者预后的重要因素，因此Ezrin的异常表达可能预示着患者的预后不佳，其测定有助于早期判断预后。激活的Ezrin可以使E-cadherin向细胞内聚集，导致细胞表面E-cadherin减少，从而破坏E-cadherin介导的细胞间连接，减少细胞间粘附[11]。另外，Ezrin能与CD44形成复合体而发挥作用，CD44v6 作为CD44主要变异体，其胞内C末端结构域能与Ezrin的 FERM结构域形成复合体[12]，Ezrin在细胞内作为CD44v6的锚定分子，使CD44v6与细胞骨架连接起来，CD44是基质重要成分透明质酸的细胞表面受体，因此形成透明质酸-CD44-ERM-肌动蛋白细胞骨架复合物，促进细胞-基质的粘附[13]，进而改变肿瘤细胞的运动能力，介导肿瘤细胞转移，同时与细胞外基质中配体结合，导致肿瘤细胞形态、游走性的改变，为肿瘤细胞的迁移奠定基础。而Ezrin的表达与患者年龄、发生部位等临床病理参数均无关。这与国外在其他肿瘤的多项研究结果相一致。
本研究显示，Ezrin在乳腺癌组织中的异常表达参与了乳腺癌的侵袭和转移过程。对Ezrin的深入研究将有助于我们进一步揭示肿瘤的浸润和转移机制，Ezrin作为一个新发现的与肿瘤转移相关的蛋白，有望成为判断肿瘤预后的新指标和未来治疗肿瘤转移的一个靶点。
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