厄多司坦对博莱霉素致大鼠肺纤维化发生发展的干预作用

【摘要】 目的:探讨厄多司坦对肺纤维化的干预作用及机制。方法:清洁级雄性SD大鼠24只，随机分为2组：博莱霉素组12只（气管内滴注博来霉素复制肺纤维化模型5mg/kg，0.2～0.3mL)、厄多司坦组12只（造模后用厄多司坦10mg/kg·d灌胃），各组于造模后第7、28d行肺功能检查后各处死6只，观察肺泡炎和肺纤维化的动态变化和肺组织匀浆中羟脯氨酸（HYP）、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶（MPO）含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果：①厄多司坦组大鼠肺泡炎、肺纤维化程度减轻，肺功能优于博来霉素组。②28d时肺组织匀浆中HYP含量厄多司坦组（5.93±0.24）显著低于博来霉素组（6.36±0.27）（P&<0.05）。③7d时肺组织匀浆中MDA、MPO含量厄多司坦组显著低于博来霉素组（P&<0.01），厄多司坦组SOD活力高于博来霉素组（P&<0.01），28d时上述各指标两组间无统计学差异(P&>0.05）。结论：①厄多司坦对博莱霉素致大鼠肺纤维化有干预作用，②厄多司坦干预肺纤维化的机制早期可能为通过使中性粒细胞扣压减少，增加自由基的清除使体内氧化抗氧化系统恢复平衡，使脂质过氧化损伤减轻而实现的。

【关键词】 肺纤维化；厄多司坦；羟脯氨酸；自由基；博莱霉素；大鼠

　　【ABSTRACT】 Objective:To investigate the possible effect and understand mechanisms of erdosteine in pulmonary fibrosis.Method:24 SpragueDawley male rats weighting 250±10g were randomly pided into two groups:BLM group twelve rats(Lung fibrosis was induced by intratrached injection of BLMA5 5mg/kg，0.2～0.3mL)、erdosteine group twelve rats（injected erdosteine (10mg/kg) into oesophagus once a day from lung fibrosis to induce sacrifice，killed randomly at 7th day and 28th day(n=6，at each time point)by puncturing heart to obain blood.All rats were analyzed pulmonary function before they were killed and the extent of alveolitis and collagen deposition were obsarved，The left lung tissue homogenate was used to determine the content of HYP、 MDA、 MPO and the activity of SOD of lung tissue.Results：①The degree of alveolitis and fibrosis of erdosteine group was alleviated compared to that of corresponding BLM group significantly（P&<0.05），and pulmonary function of erdosteine group rats was surpassive significantly in BLM group.②At the 28th day in erdosteine group the content of HYP in lung tissue（μg/mg）was lower significantly than that of corresponding BLM group（P&<0.05）.③At the 7th day in erdosteine group the content of MDA、MPO in lung tissue（μg/mg）was lower significantly than that of corresponding BLM group、and the activity of SOD in lung tissue (U/mg prot) was higher significantly than that of BLM group（P&<0.01），but At 28th day there was no statistic difference(P&>0.05）Conclusion:①Erdosteine can cure Bleomycininduced pulmonary fibrosis in rats.②The possible underlining mechanisms that Erdosteine cure Bleomycininduced pulmonary fibrosis in rats may decrease neutrophile accumulation，balace oxidationantioxidation system by reducing free radical production and increasing free radical remove，to alleviate lipid peroxidation damage.

　　【KEY WORDS】 Pulmonary Fibrosis，Erdosteine，Hydroxyproline，Free Radicals，Bleomycin，Rats

　　肺间质纤维化（ILF) 是不同类型肺部损伤的晚期病变，早期表现为肺部炎症反应和过度的损伤修复，随后出现成纤维细胞增生、胶原蛋白的含量增加、肺部超微结构和胶原蛋白空间分布异常，最终导致肺泡壁的损伤和微血管功能丧失，预后差，病死率高。厄多司坦是一种新型动力型祛痰药，该药具有降低痰液的黏滞度，溶解黏液，增加黏液纤毛转运，降低痰液与气道壁的黏着力，清除氧自由基和增加痰液中抗生素浓度等作用[1] 。本研究用厄多司坦来干预博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠，通过检测大鼠肺功能指标：肺活量、肺顺应性，不同时间点肺泡炎、肺纤维化程度，羟脯氨酸含量，评价其治疗肺纤维化的效果。通过测定肺组织匀浆中超氧化物歧化酶活力，肺组织匀浆中丙二醛的含量及髓过氧化物酶含量，探讨对其肺纤维化可能的作用机制。

1 材料与方法

　　1.1 实验动物分组、造模及给药方法

　　健康雄性SD清洁级大鼠24只，体重250 ±10g（由河北省实验动物中心提供）。随机分为2组，博莱霉素组：12只，制造肺纤维化模型，大鼠用10%水合氯醛（40mg/kg）腹腔注射麻醉后，无菌条件下经颈手术，暴露气管，经环甲软骨下气管间隙穿刺，一次性缓慢注入0.2～0.3mL 含BLMA5 (5mg/kg，用生理盐水配成浓度为4mg/L)的生理盐水溶液，注射后立即将大鼠直立并旋转，使药液在肺内分布均匀，缝合切口，覆盖纱布，动物自然清醒后以生理盐水灌胃，直至处死。厄多司坦组：12只，用同法制造肺纤维化模型后以厄多司坦（10mg/kg·d）灌胃，直至处死，各组于造模后第7、28d各处死6只。各组及各时间点的动物处死前均先行肺功能检查。

　　1.2 动物肺功能检查方法

　　以10%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉动物后，将其固定在木板上，在无菌操作下做颈部正中切口，充分暴露气管，并下穿手术线待固定气管插管。在气管下段做一小“T”形切口，将自制的气管插管固定于气管内，然后将麻醉大鼠放入体描箱中，打开肺功能仪各开关，调整各项参数到备用状态后，将气管插管与体描箱中的导管联通，关闭体描箱，行肺功能检查，检查完毕后保存各项数据，待分析肺功能指标：肺活量、肺顺应性。然后将大鼠移出体描箱，放在木板上待取标本。

　　1.3 试剂与仪器

　　博来霉素A5粉剂（8mg/支）：天津太河制药厂生产。

　　厄多司坦片（商品名露畅 150mg/片）：扬子江药业集团公司生产。

　　SOD、MDA、MPO、HYP测定试剂盒 ：南京建成生物工程研究所。

　　动物肺功能分析系统： 购于北京贝兰博科技公司。

　　可见分光光度计 722：上海分析仪器厂。

　　1.4 标本的留取及处理

　　动物行肺功能检查完毕后，心脏穿刺取血处死。取右肺中叶置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24h，之后常规石蜡包埋，切片，进行HE染色和Masson染色，光镜下观察肺组织病理形态学变化，左肺叶冷生理盐水漂洗后立即剪成小块，用手动匀浆仪碾成匀浆，置于-70℃冰箱中保存，待测定MDA、MPO、HYP的含量（具体操作按试剂盒说明书进行）。

　　2009年6月张 蕾等：厄多司坦对博莱霉素致大鼠肺纤维化发生发展的干预作用第3期2009年6月河北北方学院学报（医学版）第3期1.5 肺泡炎、肺纤维化程度分级

　　根据Szapiel[2]等的方法，在光镜下观察HE染色和Masson染色病理切片分别评价肺泡炎和肺纤维化的程度，均分为4级。肺泡炎分级：0级：无肺泡炎；1级：轻度肺泡炎，肺泡隔因细胞浸润增宽，病变范围局限在全肺20%以下，肺泡结构正常；2级：中度肺泡炎，病变范围占全肺的20%～50%；3级：重度肺泡炎，成弥漫性分布，病变范围大于50%。肺纤维化分级：0级：无肺纤维化；1级:轻度肺纤维化，受累面积少于全肺20%；2级:中度肺纤维化，受累面积占全肺的20%～50%，肺泡结构紊乱；3级：重度肺纤维化，受累面积大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。

　　1.6 统计学处理

　　数据资料采用SPSS11.5 统计软件处理。实验结果中计量资料以均数±标准差（x±s）表示；同一时间点组间比较采用t检验；病理等级资料采用非参数秩和检验，以P&<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

　　2.1 一般情况观察

　　博来霉素组大鼠很快出现精神不振，被毛干枯无光泽，少动，进食少，体重减轻，唇及爪轻度紫绀，第5d死亡一只，约14d后食欲和体重有改善；厄多司坦组大鼠精神状态、进食、活动较博来霉素组好，无死亡，体重增长基本正常。

　　2.2 肺脏病理组织学改变

　　根据Szapiel[2]等的方法，博来霉素组：7d时肺泡炎性改变明显，HE染色可见肺间质及肺泡内有大量炎性细胞浸润，以巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为主，肺泡间隔增宽，伴有水肿和出血。Masson染色见肺泡间隔增宽明显，胶原纤维增多，肺泡结构改变。28d时，肺泡炎症减轻，但间质内仍有巨噬细胞浸润，成纤维细胞大量聚集，肺泡结构破坏，间隔增宽，并且炎症、纤维化、肺泡出血并见；Masson染色见大量胶原纤维呈束状或者片状沉积，肺泡壁变厚，肺泡结构紊乱（见图1、3）。厄多司坦组各时间点与博来霉素组比较表现出基本一致的变化规律，但肺泡炎和纤维化的程度较轻（见图2、4），半定量统计结果有显著差异性（P&<0.05）。各组大鼠 肺泡炎和肺纤维化的Szapiel分级见表1。图1 博来霉素组大鼠肺组织病理切片(HE染色×400）图3 博来霉素组大鼠肺组织病理切片(Masson染色×400）图2 厄多司坦组大鼠肺组织病理切片(HE染色×400）图4 厄多司坦组大鼠肺组织病理切片(Masson染色×400）表1 两组大鼠肺泡炎、肺纤维化分级注：厄多司坦组与同时间点博来霉素组相比*P&<0.05

　　2.3 肺组织中HYP含量的变化

　　肺组织匀浆中HYP含量（μg/mg）:7d时博来霉素组与厄多司坦组HYP含量分别为2.32±0.48、2.27±0.11，两组相比无显著性差异（P&>0.05），28d时博来霉素组与厄多司坦组HYP含量分别为6.36±0.27、5.93±0.24，厄多司坦组较博来霉素组减低（P&<0.05）(见图5）。 两组大鼠HYP含量比较。

　　图5 两组大鼠HYP含量比较2.4 肺功能指标变化

　　2.4.1 肺活量（cmh3O):两个时间点博来霉素组与厄多司坦组分别为6.33±1.13、8.72±1.33与5.96±1.06、9.67±1.06，厄多司坦组均高于博来霉素组（P&<0.01）（见图6）。

　　图6 两组大鼠肺活量比较图7 两组大鼠肺顺应性比较2.4.2 肺顺应性(mL/cmh3O):7d时博来霉素组与厄多司坦组分别为0.188±0.021、0.210±0.018，两组相比无显著性差异（P&>0.05），28d时博来霉素组与厄多司坦组分别为0.098±0.024、0.165±0.036，博来霉素组明显低于厄多司坦组（P&<0.01）（见图7）。

　　2.5 肺组织匀浆中SOD活力(u/mg prot):7d时博来霉素组与厄多司坦组分别为44.34±5.07、65.78±3.47，博来霉素组较厄多司坦组明显减低（P&<0.01）。28d时博来霉素组与厄多司坦组分别为72.44±3.16、70.85±4.06，两组相比无显著性差异（P&>0.05）（见图8）。

　　图8 两组大鼠SOD活力比较2.6 肺组织匀浆中MDA含量（nmol/mg prot）:7d时博来霉素组与厄多司坦组分别为2.5±0.22、1.28±0.28，博来霉素组明显高于厄多司坦组（P&<0.01）。28d时博来霉素组与厄多司坦组分别为1.24±0.18、1.09±0.27，两组相比无显著性差异（P&>0.05）（见图9）。

　　图9 两组大鼠MDA含量比较2.7 肺组织匀浆中MPO含量(u/g prot):7d时博来霉素组与厄多司坦组分别为8.63±0.47、7.42±0.33，厄多司坦组低于博霉素组（P&<0.01），28d时博来霉素组与厄多司坦组分别为7.16±0.28、6.35±0.40，两组相比无显著性差异（P&>0.05）（见图10）。

3 讨论

　　3.1 肺纤维化动物模型的评价

　　对于实验研究而言，复制合理、稳定的疾病动物模型是研究该疾病发病机制及药效机理的重要环节。 而对本实验来讲，就是要复制符合临床情况的肺纤维化大鼠模型。本实验采用气管内一次性滴注博来霉素（BLM）的给药方法制作肺纤维化大鼠模型。BLM是临床常用的抗肿瘤药物，其主要的毒副作用之一是引起肺纤维化，用其复制的动物肺纤维化模型，病理组织学和生理学改变与人类肺纤维化近似，其病理特点为早期肺泡炎导致肺损伤以及其后的弥漫性纤维化，许多细胞因子的表达、肺功能及血气分析的改变都与人类肺纤维化的变化相一致，因此已被广泛用于模拟肺纤维化发生过程，研究发病机制及筛选药物。其中支气管灌注BLM复制肺纤维化模型的方法可靠、给药剂量小、容易掌握，已成为国内外公认的成熟方法[3]。本实验结果表明，博来霉素组大鼠滴注BLM 7d后，肺损伤表现以肺泡炎为主，大量炎性细胞浸润，第28天可见较明显的纤维结缔组织增生，胶原沉积，肺泡结构破坏或消失，病损范围广泛，肺纤维化形成。这些病理改变与文献报道一致[4]，提示本实验动物模型的复制成功。

　　3.2 厄多斯坦干预肺间质纤维化的疗效评价

　　厄多司坦对肺纤维化是否具有干预作用？肺病理形态的改变和肺功能是最为直观的疗效衡量标准，HYP含量被认为是间接反映胶原含量的敏感指标，可以判断纤维化的程度[5]，本实验结果显示：厄多司坦组与博莱霉素组相比肺泡炎和肺纤维化程度减轻，病理半定量结果具有统计学差异；肺活量和肺顺应性升高；28d时HYP含量显著下降，提示厄多司坦对肺纤维化有积极的干预作用，它的作用可能在于抑制肺泡炎的发展，并抑制胶原沉积，进而减轻了纤维化的程度，减缓了疾病的进程。

　　3.3 厄多司坦干预肺纤维化的可能机制

　　尽管肺纤维化的发病机制尚不完全清楚，但越来越多的证据表明氧化—抗氧化失衡、复杂的细胞因子网络之间的相互作用在肺纤维化的发生、发展过程中发挥重要作用。活性氧在肺组织内持续产生并具有生理作用，正常肺组织内存在完整的氧化—抗氧化体系，如SOD，能及时调节和清除自由基。肺脏发生疾病时，体内自由基增加，患者机体为了捕捉和清除这些过量的自由基以恢复氧化—抗氧化的动态平衡，就必然消耗大量的SOD、 从而导致SOD 含量显著降低[6]。因此测定SOD活力的高低，间接反映机体SOD过量消耗及机体清除氧自由基的能力不足。当氧自由基（OFR）过量时，OFR能攻击生物膜中的多价不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物，MDA 是主要的产物之一，因而测试MDA 的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映体内自由基生成的情况及反映机体细胞受自由基攻击的严重程度[7]。本实验结果显示：在两组大鼠中，SOD活力、MDA活力于造模7d时有差异，而造模7d时正是肺泡炎的高峰期，说明自由基可能通过肺泡炎对肺纤维化的形成发挥作用。在7d时厄多司坦组较博莱霉素组：SOD活力显著升高，MDA活力显著降低，说明厄多司坦可以通过提高SOD活力而增强肺局部的抗氧化能力，减轻肺泡炎，抑制脂质过氧化损伤，进而抑制肺纤维化的形成。MPO是中性粒细胞（PMN）的一种特异性含氯溶酶体酶，主要存在于PMN嗜天青颗粒中，其含量的多少与PMN 的数目成正比，是其扣压的指标。在有卤素离子存在时，MPO能清除PMN吞噬过程中释放的h3O2产生次氯酸离子(HClO-) 。HClO-可氯化氨基基团，造成肽链断裂，形成小分子胺，破坏许多生物分子及细胞膜，损害机体防卫系统;能够攻击细胞膜，引起NAD+和ATP的耗竭，损伤细胞的结构和功能[8]。本实验结果显示：厄多司坦组较博莱霉素组MPO活力显著降低，说明厄多司坦通过使中性粒细胞扣压减少，进而减轻肺损伤，从而抑制肺纤维化的形成。

　　由上可见，体内氧化—抗氧化失衡在肺纤维化形成过程中发挥重要作用。厄多司坦对博莱霉素致大鼠肺纤维化有干预作用，其早期可能的机制是通过减少中性粒细胞扣压，减少其呼吸爆发产生的自由基，增加自由基的清除使体内氧化—抗氧化系统恢复平衡，从而使脂质过氧化损伤减轻实现的。

参考文献

1 周向东.常用祛痰药的临床应用评价[J].药学专论，2005，14（7）：1617

2 Szapiel SV，Elson NA，Fulmar JD，et al，Bleorrmycirrinduced interstial pulmonary disease in the nude，athymic mouse[J].Am Rev Respir Dis，1979，120:893894

3 Gharaee KM，Ullenbruch M，Phan SH.Animal models of pulmonary fibrisis[J].Method Mol Me，2005，117:251259

4 Izbicki G，Segel MJ，Christensen TG，et al.Time course of bleomycininduced lung fibrosis[J].Int J Exp Pathol，2002，83:111119

5 Cooper AD JR.Pulmonary fibrosis pathways are slowly coming into ligh[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2000，22:520523

6 Yildirim Z，Turkoz Y，Kotuk M，et al.Effect of aminoguanidine and antioxidant erdosteine on bleomycininduced lung fibrosis in rats[J].Nitric Oxide，2004，11(2)：156165

7 中柴，文戊，李永春.博来霉素致肺纤维化过程中丙二醛及透明质酸的检测[J].中国临床医学， 2003，10（3）：285

8 Vignola AM，Riccobonol，Mirabella A，et al.Sputum metalloprotei nase9/tissue inhibitor of metalloproteinase1 rato correates with airflow obstraction in asthma and chronic bronchitis [J].Am J Respir Crit，Care Med，1998，158(6):19451950