中药复肝春6号体外诱导小鼠肝癌H22细胞凋亡实验研究

　　　　 作者：张永英 刘福英 张焕铃 王俊霞

【摘要】 目的：探讨中药复肝春6号（Fuganchun 6，FGC6)诱导小鼠肝癌h32细胞凋亡的机理。方法：将FGC6制成水煎剂，过滤，最后用微孔滤膜过滤除菌。药物浓度以生药计。采用MTT法计算FGC6对h32细胞的半数致死量浓度和琼脂糖凝胶电泳对药物诱导的凋亡细胞进行DNA ladder分析，流式细胞术检测药物作用下的细胞凋亡率和细胞周期时相变化，透射电镜检测凋亡细胞超微结构的变化。结果：FGC6对h32细胞的半数致死量浓度为240mg/mL。DNA ladder分析药物组可见明显的凋亡梯状条带。FGC6作用下的小鼠h32肝癌细胞周期时相发生变化，随药物浓度的增加细胞凋亡率明显上升。透射电镜下FGCⅠ组细胞具有明显的坏死特征。FGCⅡ组肿瘤细胞可见明显的凋亡特征。结论：复肝春6号可以使体外培养的h32细胞染色体DNA断裂，阻滞在细胞周期的G1/G0 期，使h32细胞的超微结构改变等途径诱导细胞凋亡。

【关键词】 复肝春6号；细胞凋亡;细胞周期；肝肿瘤；h32细胞；小鼠

　　【ABSTRACT】 Objective:To investigate apoptosis of hepatica carcinoma cell induced by Fuganchun 6.Methods:FGC6 had been boiled in water and filtrated.Then the filter paper was used to get rid of the bacteria.The death cause of half cell effect of FGC 6 on h32 cells was examined by MTT，DNA ladder analysis for tumor cells was processed by agarose gel electrophoresis， the apoptosis and cell cycle were examined through FCM，and also morphologic examination of tumor cells was conducted through TEM.Results:The death density of half cell effect of FGC 6 on h32 cells was 240mg/mL.DNA ladder strips could be seen in FGC6 Group，stage changes of cells cycles which had been affected by FGC6 changed with the increase of FGC6 concentration，apoptosis rate of the cells significantly increased.The cells in FGCI Group showed the sign of putrescence，the contents of cells decreased and the cells melted and expanded.Part of cell nucleus membrane in FGCII Group stuck up outside and became rotundity.Conclusion:FGU6 can break the DNA of h32 cells regularly，FGU6 brings about the apoptosis of h32 cells mainly through blocking its growth during G0 stage and clear morphologic changes.

　　【KEY WORDS】 Fuganchun 6，Apoptosis，Cell Cycle，Liver Neoplasms，h32 Cells，Mice

　　随着实验模型和检测方法的完善，细胞凋亡的研究日益受到医学和药学领域的重视。在国家自然科学基金委员会临床基础学科发展战略调研报告中，多次强调了细胞凋亡研究的重要性，并将其列为肿瘤、心血管等重大疾病今后研究的方向之一。细胞凋亡在肿瘤发生发展中的重要作用及潜在意义已成为生物医学领域研究的热点和前沿之一。近年来，中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究越来越多，一些从中药中提取的生物碱以及有关单味药诱导肿瘤细胞凋亡的研究报告较多，而目前中药复方诱导肿瘤细胞凋亡的报告较少。

　　复肝春6号（FGC6）是由河北省中医院毛宇湘副主任医师根据多年临床经验拟定的，由黄芪、女贞子、牡蛎、鳖甲、莪术、白花蛇舌草、薏苡仁、半枝莲、桔梗等中药组成。方中黄芪、女贞子补气养阴，扶正固本；白花蛇舌草、半枝莲、薏苡仁清热解毒，软坚散结；莪术、桔梗理气活血，消肿散积；诸药合用，可共奏益气养阴，清热解毒，健脾利湿，软坚散结之功。临床试验发现此方剂对减轻中晚期肝癌患者的痛苦，延长患者生存期、提高生活质量有明显的效果。本研究目的是通过观察FGC6对体外培养h32细胞增殖的抑制作用以及肝癌细胞凋亡的生化及形态学变化，从细胞、分子水平探讨该方药抗肝肿瘤作用的机制，旨在为其临床应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株 小鼠肝癌细胞株（h32细胞即YAC1细胞株）由河北医科大学实验动物学部实验动物研究室提供。

　　1.2 药物 FGC6方剂中各单味中药均购自乐仁堂大药房，配伍后，以蒸馏水浸泡1h，水煎两次后混匀，过滤并浓缩，置于4℃冰箱储存备用。氟尿嘧啶注射液(5Fu)：上海旭东海普药业有限公司生产，产品批号为051104。

　　1.3 主要仪器及试剂

　　低温冰箱、流式细胞仪（美国BD公司）、透射电镜 （日立H7500）、酶标分析仪等。

　　DNA Marke（SABC公司产品）。

　　1.4 MTT法测定药物对h32细胞的半数致死量浓度

　　试验设6个组，其中2个对照组，阳性对照5Fu组（50μg/mL）及正常对照组（NS组）；另设4个药物浓度组，FGCⅠ组（480mg/mL)、FGCⅡ组(240mg/mL)、FGCⅢ组(120mg/mL)、FGCⅣ组(60mg/mL)，每组8个重复。本试验采用96孔板培养，取对数生长期h32细胞，将其细胞浓度调整为1×105个/mL，每孔加入150μL，37℃、5%CO2 饱和水汽二氧化碳细胞培养箱中培育24h后，阳性对照组加入5Fu 50μL。正常对照组加入培养液50μL。FGCⅠ组、FGCⅡ组、FGCⅢ组、FGCⅣ组分别加入不同浓度的药物50μL。共同培养48h后，加入MTT（5mg/mL）10μL，温育4h，2000r/min离心10min，弃去上清液，加入二甲基亚砜150μL，振荡混匀。酶标分析仪492nm波长处测A值，各孔的A值为测试孔的A值减去空白孔A值，按下式计算细胞生长抑制率。根据各药物组抑制百分率和药物浓度的相关性得出直线回归方程，然后求出半数致死量浓度。

　　细胞生长抑制率（%）=NS组A值加中药组A值NS组A值

　　×100%

　　1.5 药物对体外培养的h32细胞的促凋亡作用

　　试验设4个组，其中2个FGC6药物浓度组，分别为FGCⅠ组（480mg/mL）、FGCⅡ组（240 mg/mL）；2个对照组，分别为阳性对照5Fu（50μg/mL）组及正常对照组（NS组）。调整小鼠肝癌h32细胞浓度为1×105个/mL，取7.5mL于培养瓶中培养，37℃、5%CO2 饱和水汽二氧化碳细胞培养箱中培育24h后，阳性对照组加入 5Fu（50μg/mL）2.5mL，NS组加入培养液2.5mL，FGCⅠ组、FGCⅡ组分别加入不同浓度的药物2.5mL。共同培养48h后，收获细胞，进行下一步检测。

　　2009年6月张永英等：中药复肝春6号体外诱导小鼠肝癌h32细胞凋亡实验研究第3期2009年6月河北北方学院学报（医学版）第3期1.5.1 肿瘤细胞DNA ladder分析

　　收集药物作用48h的肿瘤细胞，每组约2×107个，提取凋亡细胞的DNA，进行DNA ladder分析。取NS组DNA溶液、DNA marker和各药物作用下的凋亡细胞DNA溶液各5μL，于含溴化乙锭1.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压为5V/cm，待样品迁移至凝胶长度的3/4时停止电泳，于凝胶分析系统（365nm）处观察DNA条带并照相。

　　1.5.2 流式细胞仪技术检测肿瘤细胞周期时相和凋亡率

　　收集药物作用48h的肿瘤细胞，每组约1×107个，用PBS清洗两次，用75%的乙醇固定过夜，调整细胞浓度，做成单细胞悬液，避光染色30min，上流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率，并用Multicycle DNA Acontent and cell cycle Analysis软件处理结果。

　　1.5.3 透射电镜技术检测凋亡细胞超微结构

　　4℃离心收集5×106个细胞，用PBS清洗2次。在2min之内加入2.5%的戊二醛，固定过夜，再用10mg/mL锇酸固定，逐级乙醇脱水，氧化丙烯浸透，树脂包埋，超薄切片机切片，于透射电子显微镜下观察凋亡细胞的形态学变化并摄影。

　　1.6 数据统计处理

　　表中数据均以x±s表示，所有数据均利用SAS统计分析软件GLM模型进行分析，各组均数的比较采用SNKq检验。

2 结果

　　2.1 FGC6对肝癌h32细胞的半数致死量浓度的确定

　　不同浓度组药物作用于h32细胞24h后，用MTT法测定其OD492值，经计算半数致死量为232.45～258.55 mg/mL，结果见表1。

　　2.2 肿瘤细胞DNA 琼脂糖凝胶电泳结果

　　肿瘤细胞DNA 琼脂糖凝胶电泳结果显示：FGCⅠ组、FGCⅡ组及5Fu组可见明显的梯状DNA条带，其条带大小约为180～200bp的整数倍，这说明细胞凋亡现象明显。NS组肿瘤细胞DNA完整清晰，无明显降解，无梯状DNA条带，结果见图1。表1 FGC6对肝癌h32细胞增殖抑制作用 (x±s)注：与NS组相比较▲P&<0.01，与５Fu组相比较*P&<0.05注：与NS组相比较▲P&<0.01;与5Fu组相比较◆P&<0.01

　　2.3 流式细胞仪技术检测细胞凋亡率和细胞周期分布

　　收集细胞，用75%冷乙醇固定过夜，上机前去除乙醇，PBS调整h32细胞浓度为1×106/mL，Rnase消化20min。作成单细胞悬液，荧光染色，37℃孵育30min，上流式细胞仪进行细胞周期和凋亡分析。流式细胞仪检测是通过小分子DNA片段丢失检测亚二倍体峰来识别凋亡细胞。细胞凋亡时因为有DNA的断裂丢失，细胞DNA含量就较二倍体少。检测结果显示FGC6药物作用下的小鼠h32肝癌细胞细胞周期时相发生变化，与NS组和5Fu组相比G1期细胞百分比数量明显增加，差异有统计学意义；G2期细胞百分比数量也有明显变化，差异有统计学意义；S期细胞百分比明显减少，差异有统计学意义。说明FGC6作用于肝癌h32细胞主要调控点在G1/G0期。而5Fu组和NS组相比较3个周期时相没有明显差异，结果见图2和表2。

　　图2 DNA含量分布图凋亡率检测结果显示：随药物浓度的增加细胞凋亡率明显上升。从结果看，药物组细胞凋亡率明显高于NS组，差异有统计学意义。与5Fu组相比FGCⅠ组差异有显著性，见图3和表3。注：与NS组相比较▲P&<0.01;与5Fu组相比较★P&<0.05

　　2.4 电镜技术检测凋亡细胞的超微结构变化

　　电镜技术检测FGC6作用48h的小鼠h32肝癌细胞凋亡图片显示，正常肿瘤细胞处于增殖末期，染色单体平均分配到细胞两极，核膜小泡重新包围两组染色体，相互融合形成完整的核膜，并在两极重新形成新的细胞核，胞质密度均匀，细胞器分布于细胞内，染色质松散分布于细胞核内（见图4）。5Fu组肿瘤细胞可见核膜呈锐角突起，核染色质密度增高，凝聚在核膜周边，内质网扩张呈泡状，胞浆浓缩，核染色质边集于核膜下，厚薄不均匀，细胞膜内陷，细胞器明显减少（见图5）。FGCⅠ组电镜下细胞内容物减少，细胞溶涨，细胞死亡特征明显。FGCⅡ组肿瘤细胞可见局部核膜向外呈圆球状突出，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状，核染色质密度增高，轻度边集于核膜下且厚薄不均（见图6）。

3 讨论

　　3.1 FGC6诱导肿瘤细胞凋亡的作用

　　凋亡细胞最重要的生物化学反应是内源性核酸内切酶基因的活化和表达，使细胞核内的染色质DNA在核小体单位之间的连接处被Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶降解，产生若干大小不一的寡核苷酸片段，这些片段由180～200个碱基对整数倍的寡核苷酸组成，即核小体重复单位的大小。在琼脂糖凝胶上电泳呈现梯状DNA区带图谱[1]，是凋亡的典型生化特征。本实验发现FGCⅠ组、FGCⅡ组、5Fu组肿瘤细胞DNA电泳结果中均出现凋亡梯状DNA条带，而NS组DNA完整清晰，未见降解带出现，说明这三组肿瘤细胞的凋亡率远远高于NS组。透射电镜发现FGCⅠ组细胞内容物减少，细胞内有大量空泡存在。究其原因可能是因为药物浓度过大，造成细胞大量坏死。中药诱导肝癌细胞凋亡，并不是剂量越大、时间越长越好，当药物浓度较大，作用时间延长细胞数量明显减少，而且有大量碎片，最终导致细胞膜破裂，细胞核裂解，说明有部分细胞发生了死亡而不是凋亡[2]。和FGCⅡ组相比5Fu作用后，肿瘤细胞出现典型的核膜锐角突起，核染色质密度增高，凝聚在核膜周边，内质网扩张呈泡状，胞浆浓缩等典型的凋亡特征，结合生长曲线可以说明中药FGC6号诱导细胞凋亡发生速度较慢，而5Fu作用后，发生凋亡速度较快，这和文献报道相一致[3]。这是因为药物诱导细胞凋亡的作用特点不同，可能与其对核酸DNA的作用方式不同有关，如环磷酰胺等化疗药物为生物烷化剂，具有高度的化学活性，能直接作用于细胞的核酸和酶等部位，一般以共价键结合，使细胞结构和理化性质发生变异，抑制细胞分裂，导致细胞死亡。中药复方成分复杂，一般通过细胞毒作用，即损伤DNA而发挥作用[4]。

　　通过细胞周期阻滞来诱导细胞凋亡成为抗肿瘤药物研究的一个靶点[5]。许多中药能够作用于细胞周期的某一个环节，而使细胞增殖周期受阻，诱导其发生凋亡[6]。本实验中流式细胞仪技术检测FGC6作用48h的小鼠h32肝癌细胞凋亡率和细胞周期分布显示，FGC6药物作用下的小鼠肝癌h32细胞细胞周期时相发生变化，G1期细胞百分比含量明显增加，与NS组相比差异极显著；G2期细胞百分比含量明显减少，差异极显著；S期细胞百分比明显减少，差异极显著；表明FGC6能明显阻滞肝癌h32细胞由G1期进入S期，使其停滞于G1/G0期。说明FGC6作用于肝癌h32细胞主要调控点在G1/G0期。G1期被阻断，就可以阻断DNA的复制和合成，从而能有效的控制肿瘤细胞的增殖[7]。进而导致其发生凋亡。而5Fu组和NS组相比较3个周期时相均没有明显差异，这和文献报道[8] 5Fu诱导肿瘤细胞凋亡是通过将细胞阻滞于S 期而抑制其增殖不一致。这可能是由于５Fu作用于不同细胞株的结果，但具体原因还有待于进一步研究。

　　以上研究结果说明FGC6可抑制肿瘤细胞的恶性增殖。李秀娟等[9]在复肝春6号对小鼠肝癌的抑制作用及对荷瘤小鼠免疫功能的影响中阐明FGC6诱导肿瘤细胞凋亡作用与其降低bcl2基因的蛋白表达量，同时升高bax基因的蛋白表达量有关。

参考文献

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