杜仲多糖清除亚硝酸盐作用的研究

　　　　 作者：刘晓河 王治宝 梁惠花 朱立超

【摘要】 目的:研究杜仲多糖对亚硝酸盐的清除作用。方法：采用水提醇沉法对杜仲皮中多糖进行提取，并用苯酚硫酸法测定其含量，紫外分光光度法测定多糖对亚硝酸盐的清除作用。结果：杜仲皮中多糖含量为41.46%，多糖对亚硝酸盐的最大清除率为73.41%。结论：杜仲多糖对亚硝酸盐有较强清除作用。

【关键词】 杜仲;杜仲多糖;亚硝酸盐类

　　【ABSTRACT】 Objective:To study the scavenging effect of eucomman to nitrite.Methods:Eucomman was extracted by the method of water alcohol extraction(WAE)，and the content was determined by phenol sulfuric method，then scavenging effect to the nitrite was measured with the micro UVSpectrometer 754N.Results:The content of polysaccharide in Euconmmia ulmodies was 41.46%，the maximum scavenging rate of polysaccharide to nitrite is 73.41%.Conclusion:Eucomman has significant scavenging effect to nitrite.

　　【KEY WORDS】 Euconmmia Ulmodies Oliv，EUCOMMAN，Nitrites

　　目前癌症已成为威胁人类健康的最大杀手之一，而N亚硝基化合物是目前所知的最强的化学致癌物质之一，在已研究的近三百种亚硝基化合物中，约90%具有致癌性，而N亚硝胺(nitrosodimethylamin，NDMA)能引起人和动物的胃、肝脏等多种器官的恶慢性肿瘤。正常情况下，虽然人们直接从食物中摄入的亚硝胺的量是微乎其微的，但形成NDMA类的前体物质却大量存在于食物中。例如亚硝酸盐等，亚硝酸根与仲胺无论在实验室和自然条件下，还是在人和动物体内均能反应合成NDMA，尤其在人和动物的胃中更适宜于合成NDMA[1]，阻断NDMA合成或清除亚硝胺的前体——亚硝酸根是防止癌变的有效途径。根据目前文献报道，能够起到阻断NDMA合成或清除亚硝酸根作用的物质主要有酚类、还原糖和多糖类、维生素类、氧化还原酶类等[2，3]。本实验以杜仲为原料，杜仲中含有木脂素类、环烯醚萜类、多糖、黄酮类以及硬性胶类等活性物质。现代药理证明杜仲具有延缓衰老、增强免疫、防癌抗癌、降血压、降血脂、抗菌消炎、抗病毒、愈伤等多种药理作用，引起国内外医药界广泛关注[4]。本实验用水提醇沉法提取杜仲多糖，然后在体外模拟胃液条件下，研究杜仲多糖清除亚硝酸盐的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 仪器 SHZⅢ型循环水真空泵(河南巩义英峪豫华仪器厂);TG328A型分析天平(上海天平仪器厂);HW2型电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂);754N型紫外分光光度计(上海精密仪器设备有限公司)。

　　1.1.2 试剂 杜仲：购于河北北方学院中医门诊部;蒸馏水：实验室自制;其余试剂均为分析纯。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 杜仲中多糖物质的提取

　　称取干燥的杜仲皮用95%乙醇浸泡24h，以除去色素和脂溶性杂质，倾出乙醇，药渣中加水1L，微沸煎煮1h，过滤，滤渣再用0.8L水煎煮1h，合并提取液，浓缩至200mL，加入乙醇使醇含量达到80%，静置过夜，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚、洗涤，得到灰白色粗多糖，于真空干燥器中干燥后称重，待用。

　　1.2.2 多糖含量的测定

　　1.2.2.1葡萄糖标准曲线的绘制

　　精密称取葡萄糖对照品100.4mg，用蒸馏水溶解并定容至100.00mL，即葡萄糖贮备液。精确吸取葡萄糖贮备液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL定容至100.00mL，分别取1.00mL，各加入5%的苯酚液1.00mL，迅速滴加浓硫酸5.00mL，另以1.00mL水同上操作，做为空白液，于40℃水浴恒温30min，取出冷却15min，于490nm处测其吸光度。以葡萄糖贮备液浓度对吸光度进行线性回归，得回归方程y=0.0794x+0.0004，r=0.9989。

　　1.2.2.2 样品多糖含量的测定

　　采用苯酚硫酸法，准确吸取干燥的杜仲多糖100.3mg，定容至100.00mL，即为多糖液。取8.00mL定容至100.00mL，取1.00mL按1.2.3.2项下操作测得吸光度为A，再由回归方程计算样品中多糖的含量。

　　1.2.2.3 精密度试验

　　精密吸取对照品溶液6份，每份1.0mL同1.2.3.2项下操作，测得各吸光度值，计算吸光度的RSD。

　　1.2.3 样品对亚硝酸盐清除作用的测定

　　1.2.3.1 原理 亚硝酸盐在弱酸性条件下，与氨基苯磺酸重氮化后，再与α萘胺偶合生成红色的化合物，用分光光度法测定亚硝酸盐的含量。同样条件下加入样品液，样品对亚硝酸盐清除以后，再用上述方法测定剩余的亚硝酸盐含量，进而可计算出被清除的亚硝酸盐的量。

　　1.2.3.2 测定方法 吸取杜仲多糖液(100.3mg/100mL)1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00mL于50.00mL容量瓶中加入25.00mL pH3.0的柠檬酸钠盐酸缓冲液，再加入100mg/kg的NaNO2溶液5.00mL，用蒸馏水定容至刻度，在体外模拟胃液，37℃下恒温1h，然后吸取1.00mL反应液于7cm2的培养皿中，加入0.4%的对氨基苯磺酸溶液2.00mL，0.1%α萘胺溶液2.00mL，摇匀放置15min后，用分光光度计在525nm处测吸光度值(Ax)，同时用相应浸提剂做空白实验(A0)，则亚硝酸盐的清除率为：清除率=(A0Ax)/A0×100%。

　　2 结果

　　2.1 杜仲中多糖物质的提取 采用水提醇沉法，当向提取液中加入纯浓度达80%时，立即出现絮状沉淀，Molish反应阳性，可认定为多糖类物质。

　　2.2 多糖含量的测定 杜仲多糖中多糖含量以葡萄糖计为41.46%。RSD=1.65%。

　　2.3 不同浓度杜仲多糖对NaNO2清除作用结果见图1。

　　图1 杜仲多糖对亚硝酸钠的清除率由图1可知，当杜仲多糖液用量为1～7mL时，其对亚硝酸钠的清除率逐渐增加，最大清除率在加入6mL多糖左右，相当于多糖浓度4.98%，最大清除率为72.1%。

　　3 讨论

　　3.1 多糖是一类高效低毒的药物成分，对人体具有抗癌作用，普遍认为多糖是通过增强机体免疫来达到防病治病的作用的，本实验从另一角度验证了杜仲多糖的抗癌作用，即从致癌物质N亚硝胺的合成入手，通过清除合成N亚硝胺的前体物质——亚硝酸根，达到阻断致癌物质的合成，从而起到预防癌症的目的。

　　3.2 本实验在体外模拟胃液的条件下，测定了杜仲多糖的浓度为4.98%时，对亚硝酸钠的清除率最大，为72.1%，说明杜仲多糖对亚硝酸根具有较强清除作用。

　　3.3 杜仲原料易得，药用历史悠久，毒副作用小，作为预防癌症的药物开发利用前景可观，有望成为一种经济有效的预防癌症的天然生物新资源。

参考文献

　　1 宋茹，伟荣编.微波法浸提桔皮类黄酮及其对NO2-清除作用的研究[J].食品研究与开发，2007，28(7)：2528

　　2 许钢.玉米提取物抑制亚硝化反应的研究[J].中国粮油学报，2004，19(4)：4245

　　3 谭志伟.茗荷水溶性多糖体外抗氧化性能的研究[J].安徽农业科学，2008，36(2)：433434，628

　　4 柳娜.杜仲中活性成分的分离及其药理活性研究[J].分析化学，2006，12(1)：6066