作者：刘进军 乔海霞 张彦霞 李采青 王晨红 张玉妥
【关键词】 嗜血菌/流感;标本;保存/生物学
在微生物检验工作中，成功进行细菌菌种保存，对于研究细菌的生物学特征、探讨耐药性变异的机理、监测医院感染病原流行趋势以及开发新药等至关重要。我教研室为了将临床分离的流感嗜血杆菌保存下来，以备将来进行单克隆抗体制备、疫苗研制等项研究，我们尝试了四种流感嗜血杆菌的保存方法，其中包括：甘油血清肉汤法、脱脂牛乳法、纸片法和真空冷冻干燥法。保存1个月、3个月、6个月、1年后将菌种复苏进行了比较，试图从中找到一个最佳的保存方法。
1 材料与方法
1.1 菌种及标本来源 临床菌株为河北北方学院附属第一医院儿科门诊及幼儿园正常儿童咽部的分离株，共32株，均通过卫星现象鉴定为流感嗜血杆菌。
1.2 方法
1.2.1 甘油血清肉汤法 甘油肉汤按照1∶1混匀后121.3℃ 15min，冷却后无菌加入10%血清混匀，取0.5mL分装于1mL eppendorf中，放于支架上合盖但勿盖严，挑取巧克力平板上生长旺盛的流感嗜血杆菌数个菌落研磨于此培养基中，4℃冰箱稳定1h之后，放入-20℃保存。
1.2.2 脱脂牛乳法[1] 买来新鲜牛乳煮沸5次，完全脱脂后取0.5mL分装于1mL eppendorf中，放于支架上合盖但勿盖严115.6℃ 15min。挑取流感嗜血杆菌数个菌落研磨于此培养基中，4℃冰箱稳定1h之后，放入-20℃保存。
1.2.3 纸片法[2] 保存菌种滤纸片购自OXOID公司的Ⅴ+Ⅹ因子无菌纸片;保存菌种玻璃瓶：临床青霉素玻璃小瓶用浓度10%的84消毒液浸泡12h，用洗洁精洗涤后，用清水冲洗5次，最后用蒸馏水冲洗10次，温箱烘干后高压灭菌备用。用无菌小镊子夹住Ⅴ+Ⅹ因子滤纸片，用无菌接种环挑取流感嗜血杆菌涂划于其上，小心放入菌种保存玻璃瓶内，每瓶一片并做标记。将装有菌片的玻璃瓶放置在-20℃塑封保存。
1.2.4 真空冷冻干燥法[3] 冷冻干燥箱、干燥机等。流感嗜血杆菌纯培养物接种于37g/L牛心浸液+0.03%氯化血红素+0.01%辅酶Ⅰ中培养36h后，用无菌毛细管吸取菌液放到eppendorf中，于-20℃冰箱稳定1h，然后放置到冷冻干燥机干燥箱内冻干，抽真空后4℃冰箱保存。
1.3 复苏鉴定
分别在上述菌种保存1个月、3个月、6个月、1年的不同时期，取出进行复苏鉴定。甘油血清肉汤法和脱脂牛乳法保存的菌种，从冰箱取出溶解后直接倾注于巧克力平板上;纸片法和真空冷冻干燥法保存的菌种，取出后放入0.5mL无菌盐水中，充分振摇混匀后，放入35℃的中孵育30min，然后分别将菌液倾注于巧克力色平板，放入烛缸，35℃培养24～48h，观察各菌株存活情况，并转种血平板进行卫星现象鉴定，排除污染的可能性。
1.4 统计学处理 所得数据用χ2检验行统计分析。
2 结果
采用四种方法保存32株流感嗜血杆菌，1个月、3个月、6个月、1年效果比较见表1。
2.1 脱脂牛乳法保存1个月、3个月和6个月之间差异无统计学意义(P&>0.05);但1年保存存活率明显下降53.1%，与1个月、3个月和6个月比较差异有显著性(P&<0.01)。
2.2 真空冷冻干燥法四个时间段保存流感嗜血杆菌存活率之间差异无统计学意义(P&>0.05)。
2.3 甘油血清肉汤法与脱脂牛奶保存法及真空冷冻干燥法在相同时间段存活率比较，差异有统计学意义，其中1个月存活率比较P&<0.01;而3个月、6个月、1年存活率比较P&<0.001。
2.4 纸片法与脱脂牛奶保存法及真空冷冻干燥法在相同时间段存活率比较，差异有统计学意义(P&<0.001)。表1 32株流感嗜血杆菌不同保存方法存活率对比(%)
保存方法1个月存活率3个月存活率6个月存活率1年存活率甘油血清肉汤法43.9(7/32)21.9(7/32)18.8(6/32)6.3(2/32)脱脂牛乳法93.8(30/32)87.5(28/32)87.5(28/32)53.1(17/32)纸片法6.3(2/32)6.3(2/32)3.1(1/32)0真空冷冻干燥法96.9(31/32)96.9(31/32)93.8(30/32)93.8(30/32)
3 讨论
由于流感嗜血杆菌生存能力较差，需及时转种及保存，即使在4℃冰箱内一旦菌种放置时间超过3d，再次转种也不易获得成功[4]。通过反复探究我们总结出以上四种主要的保存方法，从其复苏后存活率对比来看，用真空冷冻干燥法流感嗜血杆菌平均存活率为93.8%～96.9%，此法是先将细菌在低温中迅速冷冻，然后在高真空状态下迅速脱水干燥，真空密封而成。虽然效果最好，但此法操作繁琐、费时、费力，需价格昂贵的冷冻真空干燥箱和真空泵等设备故成本较高，给实际工作带来诸多不便[5]。甘油血清肉汤法利用甘油作为脱水剂的原理，在临床中应用较多，而且简单方便保存一般菌种效果也非常好，但是实验结果显示此方法不宜保存苛养菌，流感嗜血杆菌1个月存活率仅为43.9%，与真空冷冻干燥法相比差异有显著性。而吴茂红[1]提供的纸片方法虽然强调不可以保存苛养菌，但是我们根据理论上流感嗜血杆菌生长需要的原理改良，采用OXOID公司的Ⅴ+Ⅹ因子无菌纸片作为载体，结果显示此方法仍不适合保存苛养菌，与蒋金芬[2]报道一致。而脱脂牛乳法的牛奶未经工业加工处理，营养成份基本上未丢失，无任何添加剂，有利于流感嗜血杆菌的代谢，-20℃冰箱保存，6个月、1年内存活率分别为87.5%和53.1%，与真空冷冻干燥法比较，6个月内存活率差异无显著性意义(P&>0.05)，因而此法保存流感嗜血杆菌效果较好，基于其方法简单，在不超过半年内，作为短期保存流感嗜血杆菌较为理想的保存法，具有较高的推广价值，特别适用于从事流感嗜血杆菌研究的科研和教学单位。
众所周知，流感嗜血杆菌是一种营养要求比较苛刻的细菌，营养要求高，比较难于培养和保存。按照最早的保存流感嗜血杆菌的方法[6]是在巧克力色平板上传代并保存于4℃冰箱，周期为7～10d，这种方法反复传代繁琐而且容易引起菌种变异。通过我们的对比实验建议把脱脂牛乳法作为菌种保存的推广方法，因为其既然可以短期保存苛氧菌[1]，也应该可以用于其它细菌的保存，本实验室正在观察其他临床标本保存于以上四种方法的实用性和稳定性。
参考文献
1 吴茂红，吴时耕.菌种保存方法介绍[J].江西医学检验，2004，22(6):545546
2 蒋金芬，韩红萍，梁友方.滤纸片法低温冷冻保存菌种的实验室应用[J].中国公共卫生，2006，22(3):310
3 吴爱武，刘文恩，陈艺林，等.临床微生物学与检验实验指导[M].第3版.北京:人民卫生出版社，2008.2627
4 邱景富，张玉妥，张艳芳，等.聚合酶链反应检测儿童急性呼吸道流感嗜血杆菌感染的研究[J].张家口医学院学报，2003，20(2)：12
5 罗桂梅，刘红军，刘三九.淋球菌保存方法的实验研究[J].实用预防医，2007，14(1):192193
6 刘运德主编.微生物学检验[M].第2版.北京:人民卫生出版社，2004.116117