骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化及临床应用前景

　　　　　　作者：张江兰 赵文会 王海萍

【摘要】 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有自我更新和多向分化潜能，在一定的诱导条件下可以向心肌细胞(cardiomyocytes，CM)分化。BMSCs能通过取代缺血坏死区的心肌细胞，在损伤区域形成毛细血管，修复损伤的细胞外基质，分泌多种细胞因子等作用机制来治疗心血管疾病。目前BMSCs在实验与临床的研究方面取得了初步的成果，为各种心血管疾病的治疗提供了一种全新的选择;并且在基因组织工程和分子生物学方面对BMSCs的应用与治疗心血管疾病做了更深层次的研究。为探索BMSCs成为治疗心血管疾病最有前途的“种子”细胞打下了基础。

【关键词】 骨髓;间质干细胞;细胞分化;肌细胞/心脏

近年来，随着基因工程和组织工程技术的提高，干细胞的研究特别是对组织干细胞的可塑性研究，成为了热点。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞群体，根据其来源将其分为两类：成体干细胞和胚胎干细胞。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)属于成体干细胞，具有高度可塑性，且来源广泛，易于在体外扩增，还可以诱导分化为多种组织细胞，并易于被外源基因转染且稳定表达的特点。因此，成为组织工程领域的研究热点。目前，各种心肌梗死和心力衰竭治疗效果不佳的最主要原因在于：大量有收缩功能的心肌细胞丢失，没有得到很好的解决[1]。目前BMSCs移植替代受损心肌用于心肌重建取得了可喜进展。许多科学家在BMSCs向CM分化方面做了很多尝试性研究，也为BMSCs移植治疗心血管疾病奠定了基础。

　　1 骨髓间充质干细胞的生物特性

　　BMSCs来源于中胚层，存在于全身结缔组织和器官间质中，是具有跨胚层分化潜能的成体干细胞，在骨髓中含量最丰富。具体有以下特性：(1)自我更新能力：通过不对称分裂一方面实现增殖与分化，另一方面维持自身干细胞数量的稳定。(2)多向分化能力：具有广泛的分化潜能，既往大量实验证实：在合适的分化条件下不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞等，而且可以跨胚层分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞和内胚层的肝细胞、内皮细胞[24]。(3)形态和生长方式：在形态上呈现为成纤维样和不规则形，胞浆丰富、核染色质细、核仁明显，平行排列或螺旋样生长。在体外具有很强的增殖能力，可以在体外大

　　量扩增和长期培养，并且可以长时间保持其分化状态。(4)免疫表型：目前就其特异性标志物尚无统一意见，但多数学者认为BMSCs表达CD166，CD105，CD102，CD90，CD54，CD50、CD49、CD44、CD29、Sh3、SH3、1L6、1L7、1L8，1L11、1L12、1L14、SCF、GCSF、GMCSF等。不表达细胞表面抗原CD14、CD31、CD34、CD45、CD117、CD133和主要组织相容性复合分子，如HLADR。

　　2 BMSCs向心肌细胞的分化

　　目前，许多科学家和实验小组对BMSCs向CM分化的诱导条件以及影响因素作了大量尝试性研究，希望能够明确BMSCs分化为CM的调控机制以及影响因素，以至能有效、大量、可控制的应用于临床。

　　2.1 5氮杂胞苷诱导BMSCs向CM分化的机制

　　5氮杂胞苷是一种去甲基化药物，推测其诱导干细胞心肌分化可能与其控制向心肌分化的特异启动子基因上阻遏蛋白结合，使其去甲基化而发生构型变化，从而启动细胞向心肌分化。早在1984年，Konieczny等就支持5氮杂胞苷能诱导BMSCs向CM转化与5氮杂胞苷分子中的甲基有关。有学者认为5氮杂胞苷能引起细胞DNA中某些胞嘧啶去甲基化，推测与肌源性基因Myo激活有关[56]。胡昕婴等[7]的研究中，用5氮杂胞苷成功地诱导人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向心肌细胞定向分化。心脏特异转录因子如Csx/Nkx2.5、GATA4在心脏发育过程中起主要作用。Nkx家族中的Nkx2.5与胚胎心肌细胞分化关系最为密切。Nkx2.5可激活其他心肌转录因子如GATA4、肌细胞增强因子2c(myocyte enhance factor，MEF2c)的表达。Nkx2.5及其表达水平对胚胎时期心肌前体组织定向分化起了调控以及维持的作用，但在出生后除心脏外其他器官不再表达Nkx2.5[8]。张文等[9]在研究BMSCs体内诱导分化为CM过程中相关调控基因的时序表达时认为，Nkx2.5在BMSCs转化为CM的过程中发挥重要作用，胡昕婴等[7]通过实验研究显示hBMSCs经5氮杂胞苷诱导后hBMSCs表达心肌特异转录因子Nkx2.5。

　2.2 心脏微环境与BMSCs的分化

　　目前大多数观点认为心肌微环境对于BMSCs分化作用可能有两点：一是CM分泌某些细胞因子和可溶性化学物质，二是BMSCs与CM直接接触。

　　有实验[1011]表明在体外培养CM中，模拟心肌微环境可诱导BMSCs向CM分化。Ball等[12]对于分化的细胞直接或间接接触是否影响向BMSCs分化进行研究，发现BMSCs与何种细胞直接接触在很大程度上影响其分化过程。王玲范等[13]通过实验证实，BMSCs与CM直接接触组中BMSCs高度表达cTnT、Nkx2.5及GATA4，非接触组的BMSCs未见cTnT的表达。

　　Li等[14]通过半透膜共培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞和新生大鼠心肌细胞(两种细胞不直接接触)，发现有些间充质干细胞开始搏动，通过免疫组化、RTPCR、电生理、透射电镜等检测，这些细胞有心肌细胞的特征。

　　2.3 其他相关诱导因子

　　细胞传代数、倍增时间、诱导剂的剂量及其诱导时间、细胞钙离子浓度以及培养条件等也可影响诱导BMSCs向CM分化。程芮等[15]研究结果显示，5μm/L5氮杂胞苷不仅能保持一定的诱导率，同时对细胞增殖影响小。心肌细胞和心肌组织时刻处于电磁场和力学环境中，因此，力学、电磁刺激等物理因素对间充质干细胞向心肌细胞分化必然产生重要的影响。Xia等[16]发现电磁场刺激体外培养的新生心室肌细胞，可增加心肌肌球蛋白轻链的表达，增加心肌肌纤维的数量，促进肌纤维有序排列。Ruwhof等[17]发现力学刺激能促进心肌细胞和心肌成纤维细胞分泌生长因子。

　　3 BMSCs移植治疗心血管疾病的研究进展

　　BMSCs来自于成年的细胞，可以从患者身体内获得，与其他干细胞相比，BMSCs具有明显的优势，同时也不涉及道德及伦理学方面的问题。近几年来BMSCs被大量应用于实验与临床的研究，为各种心脏病及严重心肌梗死所引起的心力衰竭提供了一种全新的选择[18]。

　　3.1 BMSCs用于动物心血管疾病治疗的实验研究

　　早在1999年时，第一次报道骨髓用于治疗心血管疾病，移植骨髓后的大鼠心功能得到了明显改善。近年来，大量学者在此方面进行了研究。宋哓蓉等[19]将兔BMSCs移植至缺血心肌后，发现在缺血心肌部位BMSCs可向心肌细胞分化，增加心肌血流灌注，改善心脏收缩功能;同时在兔体内移植BMSCs后在一定程度上可改善扩张型心肌病的心功能，使病损心肌组织病变减轻，并可能抑制心电紊乱的进一步发展[20]。在急性心肌炎模型中，BMSCs移植后明显改善炎性反应和心功能，表明BMSCs具有一定的抗炎作用[21]。

　　3.2 BMSCs用于治疗心血管疾病的临床研究

　　Chen等[22]在2004年进行世界上第一次BMSCs移植治疗急性心肌梗死的随机对照研究，BMSCs治疗组的左心室射血分数和梗死区域的室壁运动速率显著改善。于2006年该研究组报道BMSCs移植治疗能够明显改善慢性缺血性心肌病患者的心功能。同时有学者也观察到BMSCs移植治疗前壁心肌梗死和扩张型心肌病患者中能够明显改善心功能，且没有明显的不良反应发生[2324]。

　　3.3 BMSCs移植改进心肌功能的机制

　　BMSCs移植后改善心功能的机制尚不明确，但越来越多的资料显示：(1)BMSCs向心肌样细胞和毛细血管分化。一些实验证实在心肌梗死后移植BMSCs能明显增加梗死部位的毛细血管和改善心肌收缩功能[25]。(2)调节心脏局部的炎症反应[21]。(3)BMSCs移植保护和恢复细胞外基质的完整性。移植的BMSCs分泌一些基质成分修复受损的宿主细胞外基质，从而恢复宿主心肌细胞的结构支撑，限制梗死区域的扩张和改善梗死局部的收缩功能[26]。(4)BMSCs的旁分泌作用。最新的研究显示BMSCs至少分泌34种蛋白质，其中9种蛋白质在5杂氮胞苷的诱导下发生了明显变化[27]。

　　3.4 移植时机和途径的选择

　　何时行BMSCs移植才能使受体收益最大，是目前尚未解决的难题。有学者发现急性心肌梗死后1周左右，心肌炎反应有所消退，侧支循环初步形成而纤维化，瘢痕组织尚未形成，这个时间进行BMSCs移植时间应该最合适[28]。

　　对于移植途径的选择，也是目前争论的焦点。将BMSCs移植到心脏的途径包括开胸经心外膜注射、利用左心导管经心内膜注射、经外周静脉注射、经冠状动脉内和冠状静脉系统等方法。每种方法都有其优缺点，但是哪种方法是移植的最佳途径尚没有统一认识。

　　3.5 BMSCs移植的安全性

　　目前在对BMSCs移植进行的临床研究中，还没有发现明显的不良反应[2224]。但是有学者提示我们，将BMSCs直接注射到小鼠梗死心肌中，发现移植细胞呈团块状聚集，且发现明显骨化现象[29]。Vulliet等[30]在狗心肌梗死模型中经冠状动脉直接移植BMSCs，发现由于BMSCs直径较大，有造成移植冠状动脉堵塞的可能。所以为了保证BMSCs移植安全性，有待于进一步研究和探讨。

　　3.6 BMSCs移植的联合治疗

　　骨髓干细胞分化能力有限，在梗死区存活率较低，通常其对左心室射血分数(LVEF)的改善不超过9%，很多学者对BMSCs移植后存活、分化效果尚存疑问。近年来，心肌再生领域中也涌现出不少新技术，这些方法与BMSCs移植的联合应用在该领域取得了进一步治疗的效果。

　　3.6.1 联合基因治疗

　　在联合血管内皮生长因子(VEGF)上，Wang等[31]在hVEGF165转染的基础上，连续经静脉注射细胞因子7d，细胞移植后4周，联合治疗组梗死区及边缘BMSCs存活数、血管密度及左心室收缩/舒张功能显著高于其他组;在联合胰岛素样生长因子I基因治疗上，Yau等[32]在体外将质粒编码的VEGF165(pCEP4VEGF)和/或IGFI(PUC18IGFI)转染入BMSCs，然后移植入雌性Lewis大鼠心肌梗死模型中，移植后1周，BMCs+VEGF+IGFI组移植细胞的存活数最高，在随后2～4周，该组左心室射血分数的改善最为显著;在联合Akt基因治疗上，Lim等[33]建立猪心肌梗死模型后将Akt基因转染或单纯BMSCs通过冠脉途径移植，Akt基因修饰组LVEF的增加和梗死面积的减少显著优于单纯用BMSCs治疗组，该组耐受凋亡能力更强，同时胞外信号调节蛋白激酶(signal regulated protein kinase，ERK)和VEGF水平明显增加;在联合肌浆网钙离子ATP酶基因、缺氧调节亚铁血红素加氧酶1基因、血管生成因子基因、肝细胞生长因子基因等各方面也都有初步的研究。Duan等[34]将BMSCs分离，体外扩增后用腺病毒介导人类干细胞生长因子基因修饰BMSCs，结果显示可减少缺血区域面积，增加毛细血管密度以及降低胶原含量，以sry基因作为标志，发现移植细胞及其后代整合入缺血区域心肌。在联合多种基因治疗上，Yau TM等[35]学者认为，联合多种基因治疗能够与细胞因子分泌、减少凋亡、改善功能上起到协同作用。

　　3.6.2 联合细胞因子治疗

　　Xaymardan等[36]将50μL含有BMSCs(1×106)和血小板源性生长因子AB(100ng/50μL)通过心外膜途径分2次注射入大鼠心肌梗死模型的心脏前壁，结果显示联合治疗组在梗死区独立心肌细胞团数量分别是单用BMC及PDGFAB的2倍和4倍;Bartunek等[37]将成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子Ⅰ和骨形态蛋白2混合培养的BMSCs[(147±96)×106]和未处理的BMSCs[(168±24)×106]移植入狗心肌梗死模型中，12周随访发现，混合培养组梗死区局部室壁增厚，同时室壁运动评分指数降低。

　　3.6.3 联合其他干细胞治疗

　　Memon等[38]观察到骨骼肌成肌细胞联合BMSCs移植4周后，联合治疗组降低左室扩张，左室射血分数提高了17.7%，其增幅显著高于其它组，同时只在联合治疗组发现新生血管数量明显增加。

　　Min等[39]将人类间充质干细胞和/或联合人类胚胎心肌细胞1∶1移植入猪心肌梗死模型中，观察6周显示，单用hBMSCs能够显著提升心功能，然而联合治疗心功能得到更显著的提高。

　　3.6.4 联合药物治疗

　　Fujii等[40]比较了皮下注射肾上腺髓质素联合心肌内骨髓单核细胞注射在鼠心肌梗死模型中的效应，4周后血流动力学及组织学分析发现：联合治疗组在梗死面积及毛细血管密度等指标与单纯治疗组相比均得到显著改善，同时仅在联合治疗组观察到左室最大压力改变和缩短分数显著改善。Wang等[41]比较了BMSCs移植、ACEⅠ治疗和两者联合治疗对心脏间质金属蛋白酶表达的影响，认为BMSCs移植及ACEⅠ均能减少间质金属蛋白酶的表达而起到改善心脏重构的作用。双龙方是由人参、丹参制成的中药复方制剂，具有“益气养血、活血通脉”功能，李连达等[42]利用心导管技术建立中国小型猪心肌梗死模型，以双龙方与BMSCs移植合用时，可促进移植细胞在心肌的生存、分化、扩增，产生大量新生的心肌细胞及心肌小血管，促进病变的修复。

　　4 展望

　　近年来对BMSCs的可塑性及分化的研究中取得了很大进展，但也存在很多问题尚待解决。由于BMSCs具有多向分化潜能和很强的增殖能力，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，组织相容性好，低免疫原性等优点，被认为是组织工程和基因工程理想的靶细胞，有着广阔的临床应用前景。在心血管疾病的治疗方面，目前无论是从细胞培养、动物实验还是临床研究都证明了BMSCs在治疗心血管疾病中的可行性，基因工程和分子生物学机制的研究从更深层的角度探索其机制。但是在BMSCs移植中还存在许多问题有待于解决。比如：如何更好的分离和纯化BMSCs;BMSCs修复损伤心肌的机制尚未阐明;移植时间、移植途径的进一步优化;与心血管各种药物联合治疗的研究等等。总之，BMSCs在心血管病的治疗中已经得到了初步的肯定，相信在以后的心血管研究领域中BMSCs将成为治疗心血管疾病最有前途的“种子”细胞。

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