川芎嗪、尼莫地平对脑挫伤灶周围区HSP70表达的影响

　　　　　　 作者：董建峰 呼东坡 张 辉 薄爱华

【摘要】 目的：探讨脑挫伤灶周围区HSP70表达及川芎嗪和尼莫地平对其干预作用。方法：采用Feenys自由落体法复制大鼠脑挫伤动物模型。川芎嗪和尼莫地平治疗24h、48h、72h取脑切片，用SP免疫组化方法检测HSP70阳性细胞。结果：模型组HSP70在24h、48h、72h均增多，治疗组HSP70表达更高于模型组(P&<0.05)，川芎嗪和尼莫地平联合治疗组HSP70阳性细胞最多。结论：川芎嗪和尼莫地平均能上调脑挫伤灶周区HSP70表达，并保护神经元。

【关键词】 脑挫伤;川芎嗪;尼莫地平;HSP70热休克蛋白质类;免疫组织化学

　　【ABSTRACT】 Objective:To identify the expression of HSP70 in cerebral injury focus perienchyma and affection of ligustrazine and nimodipine.Methods:The cerebral injury models of rat were made by Feeneys falling boday injury and used for ligustrazine and nimodipine treatment.After 24h，48h and 72h cerebral were taken and sectioned，in which HSP70 cells were examined by SP immunohistochemistry.Results:At 24h，48h and 72h，the HSP70 protective cells were increased in model group.In the treated group it was significant increased than that of model group(P&<0.05).The HSP70 protective cells were the most in the group of ligustrazine combined nimodipine treatment.Conclusion:The ligustrazine and nimodipine could protect the neurons from cerebral injury by decreasing the expression of the HSP70 in injury parenchyma.

　　【KEY WORDS】 Brain injuries，Tetramethylpyrazine，Nimodipin，HSP70 heatshock proteins，Immunohitochmestry

　　脑挫伤是临床常见的闭合性脑裂伤，不仅挫伤区有出血坏死灶形成，在其周围即“半暗带”脑细胞也有复杂的病理变化，研究发现此区也有多种基因表达发生改变[1，2]，而HSP70的变化及药物的干预作用报道甚少。本研究以自由落体复制wistar大鼠脑挫伤模型，并且用免疫组织化学SP法检测HSP70的变化并观察川芎嗪和尼莫地平的干预作用，旨在探讨药物对局灶性脑裂伤的治疗机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组 将清洁级成年wistar大白鼠90只，雌雄兼用，分为正常对照组(15只)，假手术组(15只)，模型组(15只)，川芎嗪治疗组(15只)，尼莫地平治疗组(15只)和川芎嗪+尼莫地平联合治疗组(15只)。每组又分24h、48h和72h三组，每组5只大鼠。

　　1.2 动物模型复制及治疗剂量 Feenys自由落体法复制脑挫伤动物模型[3]。造成大鼠脑右额顶叶挫伤灶直径约0.3～0.5mm，可见中心区出血和水肿。

　　自颅骨开窗后，川芎嗪治疗组腹腔注射川芎嗪100mg/kg(由北京永康药业公司生产，每支40mg/2mL);尼莫地平组静滴1mg/kg(由保定三九济山药业公司生产1mg/mL/支);联合用药组则以上述剂量同时给药，每24h给药一次。假手术组及模型组给等量生理盐水。

　　1.3 取材及染色 自脑挫伤后24h、48h和72h分别麻醉大鼠并断头取脑挫伤灶及周围脑组织(含半暗带)。4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋和切片，切片厚度5μm。

　　兔抗HSP70多克隆抗体购自武汉博士德公司，免疫组化试剂盒SP6001和DAB显色试剂购自北京中杉金桥公司，染色程序按试剂盒规程进行。阳性对照为已知HSP70阳性乳癌切片，阴性对照用PBS替代Ⅰ抗。

　　1.4 结果判定 HSP70阳性细胞其胞质或胞质与胞核均呈棕黄色。采集切片，其位置在顶叶创伤灶周围区(即半暗带)。每组共计50个高倍视野，计数阳性细胞。

　　1.5 统计学方法

　　数据采用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　HSP70阳性细胞分散在灶周皮质各层，多为锥体型。随机采集各组50个高倍视野(×400)数据进行比较(表1)。2009年10月董建峰等：川芎嗪、尼莫地平对脑挫伤灶周围区HSP70表达的影响第5期2009年10月河北北方学院学报(医学版)第5期表1 HSP70在脑挫伤灶周围区表达(细胞个数/视野注：与模型组相比*P&<0.05，#P&<0.01，与尼+川治疗组相比△P&<0.05

　　3 讨论

　　本实验室继往研究表明，脑挫伤灶中心是重物撞击导致脑组织裂伤和出血灶形成，并伴有全脑血管收缩，尤其是早期灶周区即“半暗带”血管痉挛性收缩，脑组织明显缺血缺氧，约1～6h之后，血管痉挛减轻，如果给予尼莫地平、川芎嗪等药物可以减少缺血性损伤[4]。因此我们认为“半暗带”要经历缺血再灌注病理过程，此区由于缺血缺氧产生大量自由基，同时过氧化物歧化酶(SOD)含量下降，质膜及线粒体体膜过氧化损伤，膜结构损坏，钙泵失调，导致细胞内钙超载，兴奋性氨基酸增多，多种基因表达失控，如Cfos、Cjun、Bax、Bcl2、Caspase3、Caspase9、细胞色素C等过表达，从而造成细胞凋亡调节失控，促炎因子增加，加速炎症坏死等等[5]。

　　HSP70是热休克蛋白家族中最主要的一类，它是对温度、创伤、缺血缺氧、重金属离子和病原体感染等刺激十分敏感的应激蛋白质。有研究表明[6]HSP70可以提高细胞对各种损伤因子的耐药能力，具有神经保护作用，其主要作用途径有：①保护新合成蛋白质，辅助蛋白分子跨膜运动，折叠、伸展及多聚复合体形成，具有分子伴侣作用;②提高细胞对热刺激的耐受性及其他应激刺激的耐受性(交叉耐受性);③具有抑制Cjun损伤途径，中和凋亡前诱导因子，减少线粒体膜上细胞色素C释放，阻断线粒体介导的细胞凋亡，阻断凋亡酶激活因子的形成，提高凋亡抑制基因Bcl2的表达。HSP70对脑挫伤保护机制是多途径的[7，8]。

　　本实验表明脑挫伤灶周围区有较多的HSP70表达，24～72h过程中以24～48h表达数值较高，但是各治疗组不同时相阳性细胞数相比差异无统计学意义(P&>0.05)，此结果与Zhu等报告HSP70表达的时相近似[9，10]。刘建红等[11]报道在家兔海马中HSP70表达时相则以24h达高峰。提示HSP70可能在不同动物、不同脑区有不同表达。

　　本研究表明川芎嗪和尼莫地平能明显提高HSP70表达，与模型组比较差异有显著性意义(P&<0.05)。单独给药组间差异无显著性意义(P&>0.05)。而联合用药组上调HSP70高于单独用药组(P&<0.05)。提示川芎嗪和尼莫地平保护神经元的作用与激活神经保护基因，提高HSP70含量有关。一般认为川芎秦和尼莫地平均为钙离子通道抑制剂，尤其是尼莫地平不仅能够阻断L型钙通道，防止Ca2+内流，同时刺激钙离子ATP酶，使胞质内钙外排增加，也使线粒体、内质网储存钙能力加强。川芎嗪与尼莫地平均有松弛血管平滑肌的作用，从而扩张血管，改善脑内微循环[12]。朱晓琴[13]等发现CIR(24h)川芎嗪能上调HSP70表达，同时下调Cfos和Caspase3表达;戴瑛等[14]发现尼莫地平对脑缺血再灌注沙鼠细胞凋亡有抑制作用，同时上调Bcl2表达。我们也曾报道[15]川芎嗪和尼莫地平联合应用能明显保护CIR神经元膜性结构。说明川芎嗪和尼莫地平对神经元保护作用是多途径的复杂过程。至于它们上调HSP70的机制和作用途径仍有待进一步研究。

参考文献

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　　3 薛贵平，薄爱华.丹参注射液对脑挫裂伤皮质微血管保护作用的研究[J].陕西中医，2005，26(11)：12431244

　　4 张辉，董建峰，李卫东，等.川芎嗪联合尼莫地平对脑缺血再灌注皮质神经元模型结构的保护作用[J].时珍国医国药，2007，18(12):29562957

　　5 Bie X，Che Y，Han J，et al.Effects of gaslodiss on amino acids after cerebral ischemiareperfusion injury in rat striatum[J].Asia Pac J Clin Nutr，2007，16(11):305308

　　6 Zhang Z，Wei T，Hou J，et al.Tetramethylpytaze scavenges superoxid anion and decreases nitric oxide production in human Polymorphonuclear leukoctes[J].Life Sci，2003，72(22):24652472

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　　9 Rocha AB，Zanoni C，Freitas GR，et al.Serum HSP70 as an early predictor of falal outcome after servere traumatic brain injury in mates[J].J Neurotraum，2005 22(9):966977

　　10Zhu F，Xiang Z，Peiling L，et al.The expression and changes of heat shock protein 70 MOA and heamorheology in rat cortex after diffuse axonal injury with secondary insults[J].J Clin Neurosci，2001，8(3):250252

　　11刘建红，李福安，李建华.秦艽水煎液对家兔全脑缺血再灌注损伤模型HSP70表达的影响[J].青海医学院学报 2008，29(1)：2932

　　12曹鉴萍，张克耘.川芎嗪影响脑血管疾病的作用机制[J].辽宁中医学院学报，2006，8(3)：2022

　　13朱晓琴，雷水生.川芎嗪对大鼠脑缺血/再灌注凋亡相关蛋白的影响[J].江汉大学学报(自然科学版)，2007，35(3):7779

　　14戴瑛，丁新生，吴祖舜，等.尼莫地平对沙鼠脑缺血后细胞凋亡及Bcl2的影响[J].南京医科大学学报(自然科学版)，2004，24(6):602605

　　15Hui Z，Dong JF，Zhao QZ，et al.Ultrastractural changes of rat cortical neurons following ligustrazine intervention for cerebral ischemal/reperfusion injury[J].Neural Regeneration Res，2008，3(1):4143