神经营养因子及其推断脑损伤时间研究进展

　　　　作者：程红霞 刘玉利 常月锋 李斌 李清泉 张国徽

【关键词】 法医学;神经生长因子类;脑损伤

脑损伤时间的推断一直是法医学研究的热点，借此可以鉴别生前伤和死后伤、估计伤后存活时间。近年来随着分子生物学技术在法医学中的应用，使脑损伤时间的研究取得了可喜的成果，但至今尚未圆满解决。脑损伤时间的推断需要结合多种指标分析判断，因此寻找一些与损伤经过有良好相关性的客观指标是法医学研究的重要任务[1]。

　　脑挫伤后神经系统会发生一系列继发性损伤，影响患者的健康。研究发现，脑挫伤后大脑皮质、海马和丘脑等部位神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)分泌相对增多[2]。国内外学者对脑损伤后NTFs的研究发现，无论是缺血性的还是创伤性的，都会出现NTFs表达的增强，并出现表达的高峰期，且这种改变已经通过免疫组化和原位杂交得到证实[3]。值得注意的是，目前这方面的研究多停留在定性判断上，而对NTFs与脑损伤时间的变化规律的定量检测报道较少。有学者通过图像分析技术和统计分析方法做定量研究，但这方面的工作，特别是损伤以后多因素参与时，如何得到特异性的定量检测指标，有待进一步的研究。

　　1 NGF与颅脑损伤

　　NGF是20世纪50年代初由LeviMontalcini在小鼠肉瘤细胞内发现的第一个神经营养因子，通常称为7sNGF。NGF是一种含有α、β、γ3种亚基的多聚体，其中β亚基具有NGF的所有生物学活性，也是3种亚基中唯一具有NGF的所有生物学活性的亚基。NGF是一种“靶源性”多肽神经生长因子，通常由其效应神经元支配的靶细胞合成和分泌，其效应细胞主要有神经嵴来源的组织细胞、中枢神经元和非神经元细胞等。有学者通过放射免疫方法测定NGF蛋白水平表明，海马内NGF的含量是整个脑组织NGF含量的4倍，这些富含NGF蛋白和NGF mRNA的脑区正好是基底脑胆碱能神经分布区，NGF主要由这些脑区的胶质细胞，特别是星形胶质细胞产生。

　　NGF在生理情况下能够促进神经元的发育和成熟，在病理状态下能够保护神经元避免损伤，提高存活率，是参与损伤神经再生和修复的重要因素。在液压致鼠脑损伤后24h内将NGF输入挫伤的脑皮层内，能使大鼠记忆评分增高[4]。Lam等[5]发现脑损伤后NGF能在20min内把一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)活性减低到60%，3h内维持在50%左右。NGF通过降低谷氨酸(glutamic acid，Glu)受体激动剂NMDA和AMPA所诱发的NOS活性，保护神经元免受NO毒性损伤。作为对损伤的一种反应，脑损伤后可出现NGF和NGF受体(TrKA)表达的上调。利用自由落体打击模型致大鼠外伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)，通过ELISA检测，发现皮质、海马、小脑区NGF均有升高，并与伤后72h达到高峰，NGF mRNA在伤后24h达高峰，72h显著减少。Truettner等报道TBI可诱导压力相关基因和神经营养因子基因的表达，并在损伤区及远离损伤区脑内均存在;用原位杂交法检测NGF mRNA，于伤后早期在齿状核颗粒细胞层表达增加[6]。Yang等[7]利用原位杂交和RTPCR法检测到NGF mRNA在大鼠皮质冲击损伤后，1h就出现表达高峰。Hayes等[8]在大鼠皮质冲击损伤和液压冲击损伤两种脑损伤模型中，通过原位杂交和RTPCR法检测到海马区NGF mRNA在伤后1h和3h开始升高。Lee等人在局灶缺血性脑损伤后用免疫组化方法发现，NGF于伤后1d内在缺血区周围皮质未见表达，从缺血再灌注3d开始表达，4d达到高峰;而在非缺血区，NGF于伤后4h开始表达，7d达到高峰;TrKA在缺血损伤4h后在缺血区被诱导，在缺血周边区表达于伤后第一天达到高峰[9]。

　　国内这方面也有相关报道，徐正东等[10]通过免疫组化方法发现大鼠脑挫伤不同时间段NGF与BDNF的表达与损伤经过时间相关，认为NGF和BDNF可以用来推断脑损伤时间。邹吉敏等[11]利用ELISA法检测大鼠脑挫伤后血清NGF的变化，发现脑挫裂伤后3h大鼠血清NGF开始增高，12h达顶峰，24h开始降低，5d恢复正常水平，但7d、10d回升，提示NGF参与了脑损害与恢复的全过程，尤其在早期急性期起重要的调节作用。张雁儒等[12]利用RTPCR法发现大鼠闭合性脑损伤后，其脑组织NGF基因的表达量明显增加，3d后达到高峰，7d后开始下降，11d后则降至一般水平。陈宗云等[13]发现大鼠弥漫性轴索损伤后，海马、大脑皮层、丘脑、小脑组织中NGF于1h开始表达，12h达到高峰，7d降至正常水平，证实了NGF参与了脑损伤的损害与修复过程。但利用NGF来推断脑损伤时间还未见报道。

　　2 BDNF与颅脑损伤

　　BDNF是1982年由德国神经生物学家Barde等从猪脑提取液中获得的分子量为12.3kD的碱性蛋白质，是一种在神经元损伤后再生修复、防止神经细胞退行性病变等多方面发挥重要作用的细胞因子。近年来已有学者发现外源性给予BDNF能保护中枢神经和周围神经，修复神经损伤[1415]。研究还发现脑损伤后BDNF mRNA表达增加，其特异性受体TrKB 表达亦见增多，且时空分布与BDNF mRNA 相对应，从而扩大了BDNF的功效，增强了BDNF对神经的保护作用[16]。BDNF对缺氧脑神经元的保护作用可能通过诱导TrKB水平表达上调来实现，以TrkB受体酪氨酸磷酸化起始，经RasMAPK途径完成[17]。此外，Lindvall等[18]研究表明，若事先遭受过较轻损伤刺激的神经元在面临相继而来的非致死性较严重的损伤时，可显示出较强的耐受性。以往人们认为这种损伤耐受性可能是事先的刺激提高了热休克蛋白的水平，进而发挥神经保护作用，但目前的证据不支持这种假说，而认为是与BDNF的主导作用有关。

　　BDNF在神经损伤后的表达具有时序性差异。在大鼠脊髓损伤后12h即可观察到脊髓神经元BDNF含量的增高，5d达到高峰，7d仍高于正常水平[19]。徐正东[10]在大鼠局灶性脑缺血模型中发现BDNF于缺血6h表达增强，1d达到高峰，3d恢复正常，而NGF在1d达到高峰，持续到第7天，7d以后仍有少量表达。范琰琰[20]发现弥漫性脑损伤大鼠在伤后15min表达增强，1h达高峰，48h降到正常水平，不同部位的变化趋势一致。不同的脑损伤动物模型，BDNF表达的高峰虽不同，但BDNF的变化趋势一致，BDNF在时空上的规律变化可望成为脑损伤时间的判断指标。

　　3 CNTF与颅脑损伤

　　CNTF最早由Helfhand等在1976年发现，1984年由Barbin等从鸡睫状神经元中提取出来，1989年获得CNTF cDNA。在中枢神经系统，CNTF阳性细胞主要分布在大脑皮质、嗅球、小脑皮质下区，CNTF在细胞内定位主要位于胶质细胞胞体、突起和神经元细胞的胞核和胞浆中。在周围神经系统，CNTF主要分布在髓鞘、雪旺细胞的胞体和突起等。

　　CNTF是与NGF家族无同源性的另一类神经营养因子，具有多种生物学效应，不仅能促进多种神经元存活，影响神经元的发育、分化，而且能促进神经胶质细胞的增殖与分化。神经损伤后可见雪旺细胞CNTF高水平表达，神经轴突转运CNTF增加，提示CNTF参与了神经损伤后的修复、再生。最近发现CNTF和BDNF在神经受损后可促进髓鞘的形成[15]。在大脑中动脉阻断缺血后缺血区脑皮质与海马区CNTF表达明显上升，故CNTF具有损伤保护因子之称。研究发现NGF与GDNF在损伤后早期迅速下降但随即逐渐增高，而CNTF在损伤早期表达减少，直至3～4周神经恢复再生时才表达增加，为此联合应用多种神经营养因子治疗周围神经疾病。这些神经因子在损伤后表达的时序性差异为我们推断脑损伤时间提供了新的思路。

　　4 GDNF与颅脑损伤

　　GDNF是1993年发现并被克隆的神经营养因子。应用原位杂交及PCR技术，发现GDNF mRNA在体内神经系统分布广泛，在成年和发育期大鼠的纹状体、皮层、海马、脊髓以及外周非神经系统中也能检测到。GDNF是迄今为止发现作用最强的运动神经营养因子，对成熟或发育的运动神经元具有神经营养作用。GDNF对多巴胺神经元具有特异的营养作用，是一种有效的多巴胺神经因子，对脑缺血损伤中的神经元具有保护作用。

　　体内和体外实验均已证实GDNF在新生儿缺血缺氧性脑病中的神经治疗作用[21]。Wei等[22]检测大鼠脑缺血损伤后GDNF的表达和细胞定位情况发现：外周阻断大脑皮质和纹状体血流再灌注后2h，GDNF和GDNF mRNA表达增高，然后下降;灌注后72h 又出现第二次表达高峰。证实早期的GDNF 表达高峰来源于神经元，后期表达高峰来源于胶质细胞，且认为GDNF的内源性表达升高对保护缺血损伤的神经细胞有重要作用。

　　国内学者研究发现，在大鼠闭合性脑损伤后早期皮层中GDNF及其受体GFRα1明显表达，GDNF大量表达可持续5d，GFRα1在损伤24h后降到正常水平，两者在脑损伤后表达的时序性差异基本一致，共同参与了脑损伤的病理生理变化过程[2324]。这些研究提示观察GDNF在脑损伤后表达的变化可能作为推断脑损伤时间的一种新指标。但在不同类型的脑损伤后，GDNF的表达是否相同、GDNF的时序性表达有无稳定性、GDNF与其他脑损伤指标有无协同效应等有待我们进一步研究。

　　5 联合应用多指标推断脑损伤时间的进展

　　目前国内学者已有联合应用两种指标如cfos/NGF mRNA、GFAP/S100、bFGF/FGFR、TGF1/TGFR、HSP70/iNOS等来推断脑损伤时间，取得了可喜的成绩。研究发现大鼠脑撞击伤后，撞击部位皮层内cfos mRNA在30min、1h、3h均表达增加，而该区域内NGF mRNA在这些时间段内表达并没有增加;而海马部位cfos mRNA在30min、1h、3h表达增加，NGF mRNA1h、3h表达增加，30min并未见NGF mRNA表达增加[7]。大鼠脑挫伤后，在挫伤灶周边及海马部位GFAP阳性细胞在伤后3h、1d、5d表达增加，3d降落到对照水平，7d达到峰值;而挫伤灶周边及海马内iNOS阳性细胞在伤后12h才开始表达增加，1d、3d都达到峰值，5d开始下降，7d仍较高水平表达。何芳等[25]对脑挫伤大鼠星形胶质细胞内GFAP、S100观察发现GFAP在挫伤后1h表达开始升高，7d达到峰值，而S100在伤后12h表达才开始升高，5d达到峰值并开始下降。在大鼠液压冲击伤后6h挫伤区bFGF和FGFR1 mRNA表达开始增加，伤后12h海马区内TGF1和TGFR表达增加。为进一步筛选与脑损伤时间相关的客观敏感的指标，还需要大量的工作对指标进行量化，期望不久的将来利用多指标推断脑损伤时间将在法医学实践中成为可能。

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