大鼠实验性胃溃疡自愈期间胃黏膜组织凋亡相关因子Bax,Bcl2的表达变化

　　　　 作者：张静 陈丽薇 吕洋 吴靖芳

【摘要】 目的：探讨大鼠实验性胃溃疡自愈期间促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl2在胃黏膜组织中表达的变化。方法：胃前壁黏膜下注射冰乙酸制备大鼠胃溃疡模型，免疫组织化学法检测正常组、溃疡组、盐水组大鼠胃黏膜组织Bax和Bcl2表达变化，并应用图像分析系统软件进行积分光密度值(IOD)分析。结果：Bax阳性细胞在胃溃疡组1d即增多，表达强度强，显著高于正常组与相应盐水组(P&<0.01);之后随术后时间延长，阳性细胞逐渐减少，表达强度渐弱，至术后23d，溃疡组Bax IOD与对照组相比差异无统计学意义(P&>0.05)。Bcl2阳性细胞随术后时间延长表达逐渐增多，至胃溃疡损伤后的第6天Bcl2阳性细胞数量最多，表达强度最强，胃溃疡损伤后10d及14d Bcl2 IOD略低于溃疡后6d，但仍维持于较高水平，至胃溃疡损伤后23d，Bcl2 IOD显著降低，与正常组、盐水组相比差异无统计学意义(P&>0.05)。结论:大鼠胃溃疡自愈期间Bax与Bcl2共同参与了胃黏膜的损伤修复。在胃溃疡损伤早期以促凋亡因素为主，抗凋亡因素对溃疡胃黏膜的保护及修复作用主要是在损伤后的6～14d。

【关键词】 胃溃疡;Bcl2;Bax;免疫组织化学;大鼠

　　【ABSTRACT】 Objective:To investigate the expression of Bax and Bcl2 proteins in gastric mucosa during selfhealing of experimental gastric ulcer in rats.Methods:Acetic acidinduced ulcers were caused by injection acetic acid to submucosal of paries anterior gastricus.The expressions of Bax and Bcl2 in gastric ulcer group(GU)，normal saline group(NS)and normal group(N)were detected by immunohistochemical method，and the results of IOD were analyzed by using the image analytical systems.Results:Bax positive cells significantly increased and showed strong expression on the first day after the experimental gastric ulcer in rats，the IOD value was markedly higher than that in control groups(P&<0.01).Then the IOD values of Bax cells in GU group were gradually decreased，and on 23rd day，which had not statistical difference compared with that of the control groups(P&>0.05).The expression of Bcl2 gradually increased and the IOD of Bcl2 reached the peak(IOD=21.038±7.537)on the 6th day in GU group，which showed the reduction tendency，but on the 10th and 14th days，the IOD values still stayed at the higher level.On the 23th day in GU group，IOD decreased significantly，and had no statistical difference compared with that of control groups(P&>0.05).Conclusion:Bax and Bcl2 proteins participate in renovating the gastric mucosa during healing of experimental gastric ulcer in rats.The proapoptosis protein Bax plays main role in the early stage of the experimental gastric ulcer，and antiapotosis protein bcl2 protects and repairs stomach mucosa on 6～14d after the experimental gastric ulcer in rats.

　　【KEY WORDS】 Stomach ulcer，Bax，Bcl2，Immunohistochemistry，Rats

　　研究证实，胃溃疡主要是通过细胞凋亡方式造成的胃黏膜上皮细胞丢失[1，2]。在胃黏膜的愈合过程中，细胞凋亡明显减少，提示细胞凋亡与胃溃疡黏膜修复关系密切[3，4]。多种凋亡相关因子的激活，可调节细胞凋亡及其途径影响胃黏膜组织的愈合过程[5]，从而影响胃溃疡的发展和转归。本实验通过建立实验性胃溃疡大鼠模型，动态研究胃黏膜内促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl2在胃溃疡自愈过程中的表达变化，旨在探讨凋亡相关因子在胃黏膜愈合过程中的调控意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与标本制备

　　雄性8周龄SD大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)共69只，体质量180～230g。分为实验性胃溃疡组(简称溃疡组，GU)42只，盐水对照组(简称盐水组，NS)21只和空白对照组(简称对照组，N)6只。溃疡组按本室已建立的方法在胃体前壁近胃窦处黏膜下注入0.01mL冰醋酸，制成胃溃疡模型;盐水组模拟手术，注入等量生理盐水代替冰醋酸;正常组为正常大鼠，不做任何处理。溃疡组和盐水组均分为制成模型后1d、2d、4d、6d、10d、14d、23d组(每个时间点GU 6只，NS 3只，N 6只与1d组同时取材)。各组动物饲养条件相同，取材前将动物禁食12h，不限饮水，经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，迅速开胸，经心脏灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)250mL，固定后，迅速取出胃，沿胃大弯剪开大鼠胃壁，剪取溃疡旁约3mm×5mm的组织条，置于Bouins液中，石蜡包埋，连续切片，厚6μm，裱贴于涂有APES的载片，行免疫组化染色。

　　1.2 免疫组织化学染色

　　兔抗大鼠Bax多克隆抗体、兔抗大鼠Bcl2多克隆抗体(工作浓度均为1∶100)购自武汉博士德生物工程有限公司，SP试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡切片常规脱蜡至水，枸橼酸缓冲液(pH6.0)微波热修复，3%甲醇h3O2去除内源性过氧化物酶，滴加一抗，4℃孵育过夜，次日滴加生物素化二抗，室温30min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温30min，DAB显色，苏木精复染细胞核，以PBS代替一抗作为阴性对照。在光镜下观察阳性反应呈棕黄色。

　　1.3 形态计量与图像分析

　　用OLYMPUSCX31显微镜连接Motic Med 6.0显微图像处理软件观察阳性细胞分布、形态并进行积分光密度值测量。Bax、Bcl2阳性细胞以胞浆内出现棕黄色颗粒视为阳性，每只动物随机选择5个高倍视野，进行积分光密度值(integrated optical density，IOD)测量。

　　1.4 统计学处理

　　应用SPSS for windows11.5统计软件进行统计分析，数据以(x±s)表示，溃疡组、盐水组、正常组之间积分光密度值比较采用方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 造模后胃组织形态学改变

　　胃溃疡术后1d，溃疡组大鼠胃体前壁即可见一个直径约4mm的溃疡，边界清楚，周围黏膜充血水肿。至术后2d、4d溃疡最为明显，可见周围大网膜和肝脏粘连包裹形成溃疡底，难以分离。术后10d，溃疡组织变硬，形成瘢痕，至术后14d左右溃疡面积变小，有的已经接近完全愈合。光镜下观察，术后2d坏死黏膜脱落，局部腺体结构紊乱，炎性细胞浸润，术后4d可见上皮细胞向溃疡中心移行，术后6d溃疡边缘可见新形成的扩张腺体，手术14d后溃疡处胃壁结构逐渐完成再生，黏膜及黏膜下层近似正常。

　　2.2 免疫组织化学法检测胃黏膜Bax，Bcl2表达变化

　　Bax和Bcl2蛋白阳性反应物质均呈棕黄色，主要表达于胃腺细胞胞浆内。正常组大鼠胃黏膜Bax蛋白无阳性表达(图1)，Bcl2蛋白于个别胃腺细胞有弱阳性表达，细胞胞浆着色较浅。Bax阳性细胞于术后1d溃疡组即显著增多，表达强度显著增强，IOD达到高峰16.294±6.447，阳性细胞分布于胃黏膜全层，可见壁细胞、主细胞、颈粘液细胞阳性表达(图2);之后随溃疡术后时间的延长溃疡组Bax表达逐渐减弱，至术后14d溃疡组Bax仍有较弱阳性表达，与对照组相比差异有统计学意义(P&<0.01)，术后23d溃疡组Bax IOD与对照组差异无统计学意义(P&>0.05)。Bcl2于溃疡术后1d有阳性表达，但表达强度较弱，IOD与正常组相比差异有统计学意义(P&<0.01)，但与相应盐水组相比差异无显著性意义(P&>0.05);随术后时间延长，Bcl2蛋白表达逐渐增多，至胃溃疡损伤后6d组Bcl2阳性细胞数量最多，表达强度最强(IOD=21.038±7.537)，与正常组及相应盐水组相比差异有显著性意义(P&<0.01)(图3，4)，阳性细胞于胃黏膜全层均有分布，以靠近黏膜肌层阳性信号最强;术后10d及14d组Bcl2 IOD略低于溃疡6d组，但仍维持于较高水平，至胃溃疡损伤后23d组，Bcl2 IOD显著降低，与正常组、相应盐水组相比差异无统计学意义(P&>0.05)。各实验组Bax和Bcl2 IOD变化见表1。注：与N组比较△P&<0.05，△△P&<0.01;与NS组比较▽P&<0.01;与上一时间点GU组比较*P&<0.01

　　3 讨论

　　胃溃疡是临床常见病、多发病，其发生机制与各种刺激导致胃黏膜上皮细胞的凋亡有密切关系[1，2]。而细胞凋亡在溃疡修复过程中也起着重要的调控作用[3，4]。Bcl2家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，其中Bax与Bcl2分别是促凋亡和抗凋亡成员的重要代表，二者变化是决定细胞的命运的重要因素。当Bax表达增加时，形成同源二聚体可诱导细胞凋亡，随着Bcl2表达上升时，其可以竞争性地与Bax形成异源二聚体，从而抑制BaxBax同源二聚体所诱发的细胞凋亡[6，7]。

　　本实验建立大鼠乙酸胃溃疡模型，采用免疫组织化学法在胃黏膜组织原位检测Bax、Bcl2蛋白表达变化。实验结果显示溃疡1d组Bax阳性细胞即明显增多，表达强度强，IOD显著高于对照组(P&<0.01)，且Bax表达水平显著强于同组Bcl2表达，随溃疡术后时间的延长，Bax表达水平呈渐弱趋势，但于溃疡2d组Bax表达仍高于同组Bcl2表达，提示在胃溃疡损伤初胃黏膜组织中以促凋亡因素占有优势，胃黏膜损伤反应中有大量细胞凋亡的发生，是溃疡发生的原因之一。Bcl2蛋白在溃疡术后1d即有较弱阳性表达，随溃疡术后时间的延长，阳性细胞逐渐增多，表达强度逐渐增强，至溃疡术后6d时，其IOD达到最高，随后，Bcl2蛋白表达水平有所降低，但在术后10d及14d溃疡组其IOD仍维持于较高水平，且表达水平均显著高于同组Bax表达，至胃溃疡损伤后23d，Bcl2积分光密度值显著降低，与正常组、盐水组相比差异无统计学意义(P&>0.05)，此结果提示，在溃疡术后的6～14d抗凋亡蛋白被大量激活，保护胃黏膜组织的能力加强，参与溃疡后胃黏膜组织的修复活动。

　　盐水组在术后1d、2d时Bax和Bcl2有较弱阳性表达，说明盐水的注入和手术创伤对大鼠胃黏膜也形成了一定程度的刺激，机体处于应激状态，但影响较小。到术后4d时，与正常组相比差异已无统计学意义(P&>0.05)。

　　因此，我们认为在大鼠胃溃疡自愈期间Bax与Bcl2共同参与了胃黏膜的损伤修复作用，在胃溃疡损伤早期以促凋亡因素为主，抗凋亡因素对溃疡胃黏膜的保护及修复作用主要是在损伤后的6～14d。

参考文献

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　　3 刘磊，林洁.胃黏膜愈合和细胞凋亡概述[J].现代西医结合">中西医结合杂志，2008，17(14)：22672268

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