作者：陈广琴， 刘 晨， 张成喜， 蒙荣森， 陈保林， 熊肇军， 董吁
【摘要】 【目的】 研究AMP激活的蛋白激酶 (AMPK)及血红素氧合酶HO-1激活对心肌肥大的影响，以及HO-1在AMPK抑制心肌肥大中的作用。【方法】 以培养的新生大鼠心肌细胞为研究对象，采用蛋白免疫印迹杂交方法检测5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)对AMPK的磷酸化程度及对HO-1的影响，并测定心肌细胞 [3H]-亮氨酸掺入率及心肌细胞表面积，观察AMPK及HO-1心肌细胞肥大的影响。【结果】 AICAR对AMPK及HO-1均有激活作用，AICAR能阻断AngⅡ引起的心肌肥大效应;阻断HO-1的激活则能减弱AICAR的抑制作用。【结论】 AMPK具有抑制心肌肥大的作用，AMPK能激活HO-1，HO-1在AMPK抗心肌肥大的机制中起重要作用。
【关键词】 AMPK; HO-1; 心肌肥大
Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of AMPK and HO-1 activation on hypertrophic cardiac myocyte， and the effect of HO-1 in the mechanism of AMPK inhibition of cardiomyocyte hypertrophy. 【Methods】 Cultured rat neonatal cardiacmyocytes were incubated with AngⅡ to induce cardiac hypertrophy. Cardiac myocyte surface area and [3H]leucine incorporation was measured to determine the effect of AMPK and HO-1 on cardiac hypertrophy. The effect of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR) on adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) phosphorylation and HO-1 activaton were detected by Western blot. 【Results】 Compared with control group， activated AMPK significantly enhanced the transcriptive activity of AMPK， and increased HO-1 protein expression in cardiac myocyte. The increasement of cell surface area by Ang Ⅱ was significantly inhibited after treatment of AICAR. However， this inhibitory effect was attenuated by HO-1 inhibitor. 【Conclusion】 AMPK can attenuate the cardiac hypertrophy induced by Ang Ⅱ， AMPK can upregulate the HO-1 in cardiac hypertrophy induced by AngII. HO-1 play a significant role in the effect of the AMPK on inhibiting cardiac hypertrophy.
单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种在真核细胞生物中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要调节代谢和能量。AMPK由α，β和γ亚单位组成，其中α的α1和α2亚型主要分布于心肌[1-3]，心肌细胞中的AMPK的激活与心肌缺血、氧化应激及一些刺激因素如儿茶酚胺及血管紧张素有关[4-6]，最近有研究表明，AMPK能通过抑制心肌细胞蛋白质的合成减轻心肌细胞肥大[7]。HO-1是血红素氧合酶(HO)的同工酶之一，可被多种刺激因素如：缺血再灌注、热休克、重金属和低氧等诱导表达升高。HO-1作为一种新型的心肌保护因子，通过其产物的抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗心律失常等作用在心血管疾病中发挥着重要的保护作用[8-11]，近年来一些研究结果显示，HO-1具有抑制心肌细胞肥大的作用[12-13]。基于AMPK与HO-1在抑制心肌细胞肥大中均起着重要作用，两者均能被缺血、氧化应激及血管紧张素等诱发表达增高，且AMPK的一些下游因子如p38MAPK，NO等参与了HO-1的激活[14-16]。这提示着两者间可能存在着某种关系。为验证上述假设，本研究通过观察AMPK激动剂AICAR对AMPK及HO-1的激活作用，以及AMPK、HO-1以及HO-1阻断剂锌原卟啉Ⅸ(ZnPPⅨ)对心肌肥大的影响，旨在证实心肌细胞中HO-1在AMPK 抗心肌肥大的机制中起重要作用，力图从全新的角度探讨AMPK对心肌肥大的作用。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
AngⅡ(Anaspec); AICAR(Cell sinaling);Compound C(Merk)，[3H]-Leucine(北京原子能研究所，放射性浓度为3.7 × 107 Bq/mL);即用型免疫组织化学试剂盒(迈新公司)，ZnPPⅨ(Ssigma);DMEM F12培养基及新生牛血清(Hyclone);HO-1抗体(Abcam);Phospho-AMPK-alpha(Thr172)抗体、AMPK-alpha 抗体(CST)，GADPH(上海康成)，羊抗小鼠和羊抗兔IgG-HRP(武汉博士德)，BCA-200蛋白定量试剂盒(Pierce);PVDF膜(Millipower);ECL(碧云天)。
1.2 新生大鼠心肌细胞原代培养
新生1 ～ 2 d SD大鼠心室肌组织剪碎(1 mm3大小)。以0.5 g/LⅠ型胶原酶消化。置于37 ℃恒温槽轻轻振荡2 h，之后弃去悬液，加入0.125 g/L胰酶消化5 min，收集心肌细胞至上述含培养基的离心管中中止胰酶反应。重复2 ～ 3次至细胞团块消失，8 000 r/min(r = 7 cm)离心10 min并清洗，共2 ～ 3次。加入含新生牛血清100 mL/L的培养基7 ～ 8 mL中，充分吹散细胞;过滤去除杂质;置于60 mm培养皿中贴壁60 ～ 90 min。以去除成纤细胞。吸取未贴壁的心肌细胞，进行细胞计数后按浓度1 × 106/mL/孔的浓度接种于6孔板，加BrdU 0.1 mmol/L以抑制成纤细胞生长。第2天换液，此后每隔2 d及实验干预前换液，取培养第3 ～ 4 d的细胞进行实验研究，处理前24 h换为无血清培养基。用免疫细胞化学方法对培养的心肌细胞进行纯度鉴定。加入AngⅡ(10-7 mmol/L)、AICAR(1.0 mmol/L)、Compound C(10-7 mmol/L)等处理24 h，分为正常对照组(control)、AngⅡ、AngⅡ+AICAR、AngⅡ+AICAR+Compound C、AngⅡ+Compound C组。
1.3 Western Blot 分析
用Western blot法，内参照分别为AMPK-α和GAPDH。抽提各组培养心肌细胞的蛋白并测定其浓度，取100 μg蛋白样品进行电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，用封闭液室温封闭2 h，加一抗(兔抗大鼠phospho-AMPK-α抗体，抗体稀释度为1：2 000或HO-1抗体， 抗体稀释度为1：2 000)室温孵育2 h，加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(1：2 000或1：15 000)室温孵育1 h，每次孵育完毕后用TBST漂洗3 × 5 min，将膜与化学发光增强剂室温孵育1 min后用X线胶片曝光显影。此PVDF膜洗脱后再用AMPK-α抗体孵育，重复上述二抗孵育、漂洗和显影等步骤。对显影条带进行密度扫描定量，imageJ图像分析系统测各条带平均吸光度(A)值和条带的面积，以phospho-AMPK与AMPK的光密度比值反映AMPK磷酸化的程度;以HO-1与GAPDH的光密度比值表示HO-1表达的程度。
1.4 [3H]-leucine掺入法测定心肌细胞蛋白质合成
细胞种植于24孔板中，培养2 ～ 4 d后加入AngⅡ、AICAR、ZnPPⅨ(10-6 mmol/L)等处理24 h，分为control、AngⅡ、AngⅡ+ AICAR、AngⅡ+ AICAR + ZnPPⅨ组。并同时将终浓度为3.7×104/mL的[3H]-leucine加入24孔板(0.5 mL)中，37 ℃孵箱中继续培养24 h后弃上清，预冷PBS洗涤，晾干，每孔细胞加入 1 mL 50 mL/L 的三氯乙酸 (trichloroacetic acid，TCA)清洗2 ～ 3遍，冰上放置 20 min，弃上清，每孔加 0.5 mL 0.5 mol/L NaOH室温裂解30 min，收集细胞裂解液并转移至闪烁瓶中，加 3 mL水溶性闪烁液，混匀后于液体闪烁计数仪测定样品的每分脉冲数n(CPM)。结果以对照组细胞[3H]-leucine掺入作 100%，各组均以[3H]-leucine掺入百分率表示。
1.5 心肌细胞表面积的观察和测量
免疫化学染色：心肌细胞接种前，将无菌盖玻片放入6孔板，制作细胞爬片(心肌细胞接种数量为每孔1 × 105个心肌细胞)。按实验分组(分组同1.4)加入AngⅡ等处理24 h后，取出细胞爬片以40 g/L多聚甲醛溶液固定20 min;免疫组化用SP法，一抗为抗α-肌原纤维辅肌动蛋白(anti-sarcomeric α-actinin antibody;1：200)，二抗后PBS冲洗3 × 5 min;DAB显色;苏木素复染;中性树胶封片。心肌细胞免疫组化染色片于摄影显微镜下拍照(× 400)，每个切片随机选取40 ～ 50个边界清晰可辩的心肌细胞，测量其表面积，取平均值。采用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(IPP6.0)处理。
1.6 统计学分析
所有数据均以均数 ± 标准差表示。完全随机设计资料的多个样本均数比较采用单因素方差分析，所有数据均采用采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，P &< 0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 心肌细胞纯度
倒置显微镜下观察，培养48 h的心肌细胞已展开， 80% 融合成片，搏动呈同步性。用抗α-actinin对培养心肌细胞进行免疫细胞化学染色，95%以上的细胞为心肌细胞。
2.2 AICAR对心肌细胞AMPK磷酸化的影响
AICAR干预细胞24 h，Western blot结果显示(图1)，与正常对照组相比，AngⅡ+ AICAR、AngⅡ组p-AMPK/AMPK灰度比值均增高(P &< 0.05)，AngⅡ+ AICAR组增高更为明显，而AngⅡ+ AICAR + Compound C、AngⅡ+ Compound C组p-AMPK/AMPK比值则明显低于AngⅡ+ AICAR和AngⅡ组(P &< 0.05)，与正常对照组相近。提示AICAR能明显诱导AMPK的磷酸化增加，而Compound C则抑制AMPK的磷酸化。
2.3 AICAR对心肌细胞HO-1蛋白表达的激活
Western Blot结果显示(图2)，AICAR处理细胞24 h后，与正常对照组(HO-1/GAPDH比值为1.58 ± 0.17)相比，AngⅡ组、AngⅡ+ AICAR组HO-1表达均增加(HO-1/GAPDH比值分别为2.04 ± 0.22、1.79 ± 0.17， P &< 0.05)， AngⅡ+ AICAR组HO-1表达最高，而Compound C抑制了AICAR对HO-1的激活作用(AngⅡ+ AICAR + Compound C组HO-1/GAPDH比值为0.67 ± 0.16，与AngⅡ+ AICAR相比P &< 0.05、AngⅡ+ Compound C组HO-1/GAPDH比值为0.72 ± 0.15，与AngⅡ组相比P &< 0.05)。
2.3 AMPK和HO-1对心肌细胞肥大的影响
结果如图3、图4所示，AngⅡ组能引起细胞[3H]-leucine掺入率升高，心肌细胞表面积增大，而AICAR能明显减低其所引起的[3H]-leucine掺入率升高，心肌细胞表面积缩小，在加入HO-1的阻断剂ZnPPⅨ后细胞表面积增大，[3H]-leucine掺入率表现为明显升高。
3 讨 论
心肌肥大是引起心血管疾病发生率和死亡率显著升高的独立的危险因素，是高血压、瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心脏病等临床常见疾病的一种并发症。其特征是心肌细胞体积增大、蛋白质合成增加及肌节增多[17]。
AMPK是一个重要的蛋白激酶，其组成成分主要有3个亚单位：α、β和γ[2-3]。以往的研究已证实，AMPK的生物学效应主要是对能量的调节、调节糖脂代谢、抑制蛋白质合成，近年来的研究表明，AMPK通过抑制蛋白质合成在抑制心肌细胞肥大中发挥重要作用[7];HO-1是血红素降解的限速酶，HO/CO系统作为机体的一道细胞保护的防线，日益受到重视。其产物具有抗氧化、抗炎、抗凋亡及血管舒张作用，因此在高血压、动脉粥样硬化及缺血再灌注等多种心血管疾病中起重要作用[18-19]。现有一些研究指出，HO-1也具有抑制心肌肥大的作用，能减轻内皮素及AngⅡ所致的心血管重构[12-13]。AICAR在很多实验中被用作AMPK 的激动剂，本研究通过观察AICAR对培养心肌细胞HO-1活性的影响，旨在探讨HO-1在AMPK抑制心肌细胞肥大中的作用。
本研究观察了AICAR及心肌肥大的刺激因素AngⅡ对离体心肌细胞中AMPK表达的影响。结果与之前的一些研究相一致[7]，即AngⅡ能引起AMPK的磷酸化表达增加， AICAR则能明显激活AMPK的磷酸化。而Compound C则能阻断AMPK的磷酸化;本实验还观察了AngⅡ、AICAR、以及AMPK的阻断剂Compound C对HO-1的影响，结果表明， AICAR能明显激活HO-1的表达，而Compound C则阻断AICAR对HO-1的激活，AICAR已证实为AMPK的激动剂，而Compound C为AMPK特异性抑制剂，由此可证明AMPK对HO-1有一定的激活作用。
为了探讨AMPK和HO-1对心肌肥大的影响，我们在AngⅡ诱导离体心肌细胞肥大的模型上观察了AICAR对肥大心肌细胞的影响，结果表明AICAR能减轻AngII所引起的心肌细胞表面积的增大和[3H]-leucine掺入率的增加，这就证实了AMPK在抑制心肌肥大中发挥了重要作用[7]，但在加入HO-1的阻断剂ZnPPⅨ后，AICAR抑制心肌细胞肥大的作用消失，表现为心肌细胞表面积明显增大，[3H]-leucine掺入率明显升高，与AngⅡ的诱导作用相似，这也间接证实了HO?鄄1在AMPK抑制心肌肥大的机制中起重要作用[13]。
综合上述研究结果，这也就提示着HO-1很有可能作为AMPK的下游产物，在AMPK抑制心肌肥大的作用中扮演重要角色。但AMPK通过何途径引起HO-1的激活尚不明确，因此有必要进一步研究AMPK激活HO-1的机制，从而为探讨AMPK抑制心肌肥大的作用提供更多依据。
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