【摘要】 目的 建立一种适用于生化自动分析仪动力学测定磷酸甘油酸变位酶（phosphoglyceromutase，PGAM）的方法并评价此方法的可靠性。为进一步探讨人体血清PGAM活性在急性心肌梗死和脑出血等疾病中的早期作用建立良好的方法基础。方法 PGAM活性测定采用3-磷酸甘油酸为底物，经烯醇化酶等一系列偶联，以340 nm波长在自动分析仪上测定，根据NADH吸光度变化可求出PGAM总活性。结果 通过一系列参数的测定建立了良好的能适应生化自动分析仪的PGAM活性测定方法。结论 全自动酶偶联法操作简单、测定快速、稳定性好，灵敏度和精确度高，抗干扰性强，可在全自动生化分析仪上应用。
【关键词】 磷酸甘油酸变位酶 心肌梗 脑出血 动力学法
Abstract：Objective To establish a method applicable to assay PGAM in an automatic biochemical analyzer dynamics and to evaluate the reliability of this method. To further explore the early role that human serum PGAM activity plays in acute myocardial infarction and cerebral hemorrhage， and other diseases and as a result find out a desirable method. Methods The activity was determined by 3 - phosphoglycerate as substrate， the enolase and a series of coupling to 340 nm wave-length automatic analyzer in the determination of total activity could be derived. Results Through a series of parameters determination， a good automatic biochemical analyzer to the PGAM assay was established.Conclusions Automatic-coupling method has the advantage of simplicity， fast-determination， good stability， high accuracy and sensitivity， and strong anti-interference， availability to the automatic biochemical analyzer.
Key words： PGAM; myocardial infarction; cerebral hemorrhage; kinetic
磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyceric acid mutase，PGAM)广泛分布人体全身各组织器官，主要定位于细胞溶胶中。PGAM酶是糖代谢与分解酶系之一，所催化的反应是糖分解代谢中间环节，现知PGAM是不同基因指导合成的M和B亚基组成的二聚体。聚合成MM、BB、MB三型，MM主要存在于骨骼肌和心肌;BB型主要存在于脑、肝、肾和红细胞;MB型主要存在于心肌。MM、BB、MB分子量为60 000。所以建立一套能适用于生化自动分析仪，并能在临床上应用的动力学测定PGAM活性方法，对于临床实验诊断学有重要意义［1］。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 R1 ：三乙醇胺-盐酸缓冲液(pH7.6，84 mmol／L)，1 mmol／L MgSO4，0.24 mmol／L NADH， 0.71 mmol／L ADP，0.12 mmol／L 2，3-二磷酸甘油酸，9.3 ku／L乳酸脱氢酶，1.4 ku／L丙酮酸激酶，1.4 ku／L烯醇化酶［2］。
R2：三乙醇胺-盐酸缓冲液(pH7.6，84 mmol/L) 4.8 mmol／L 3-磷酸甘油酸盐。
1.1.2 仪器 贝克曼SYNCHRON-LX20全自动生化分析仪［2］121-123。
1.2 实验对象 对照组为锦州市中心血站健康体检者，男50名，女50名；疾病组脑出血患者54名，急性心肌梗死患者。
1.3 实验方法
1.3.1 测定原理
3-PGAPGAM2-PGA烯醇化酶磷酸烯醇式丙酮酸PKADPATP+丙酮酸LDNADH乳酸+NAD+
因为NADH在340 nm处有强吸收峰，吸光度下降速率与待测样品中PGAM成正比关系，监测340 nm吸光度下降△A/min，求得酶活性［3］。
1.3.2 精密度试验 活性高中低3份活性分别为74、37、8.5 U/L不同的PGAM新鲜混合血清，短时间各测定10次分别计算批内、s及CV；连续5日，将高中低活性PGAM新鲜混合血清标本插入常规标本中测定，计算批间、s及CV［4］。
1.3.3 PGAM线性范围 取PGAM混合血清，稀释成不同浓度，使样本含量依次为1/10、1/5、2/5、3/5、4/5、5/5进行测定。
1.3.4 回收率试验和稀释实验 为了证明方法的正确性，本实验依靠回收率试验和稀释试验证明。取PGAM为8.5 U/L正常人血清和74 U/L病人血清分别加10 U/L和20 U/L标准PGAM，测定与其理论值的差异。取PGAM活性为30、88 U/L的2种病人血清，分别稀释1～3倍，测定其与理论值的差异［5］。
1.3.5 稳定性试验 将3例活性分别为12.3、39.6、63.5 U/L血清在-20、4、25 ℃保存1 w，观察不同贮藏温度对样品中PGAM稳定性的影响。同时将血清PGAM活性分别为10.4、53.1、56.3 U/L经过3次冻融循环然后测定其活性［6］。
1.3.6 正常参考值范围 对160名年龄在18～60岁在中心血站检查的健康体检者，用本方法检测PGAM活性［1］311-313。
1.3.7 应用本方法测定急性心肌梗死患者的PGAM活性并与其它指标酶进行比较。取急性心肌梗死病人血清41例，在全自动生化分析仪上进行测定［2］121-123。
1.3.8 应用本方法测定测定脑出血患者的PGAM活性并与其它指标酶进行比较。取脑出血病人血清54例，在全自动生化分析仪上进行测定［2］121-123。
1.3.9 PGAM的国际单位定义为：在固定温度下，每升样品在反应体系中，每分钟使NADH转化成1微摩尔的NAD+为一个单位。
参数 样品5 μL R1 250 μL R2：45 μL 波长340 nm 反应方向(-)，动力学法测定，温度37 ℃，计算： 因数法。
2 结 果
2.1 精密度试验评价 结果本方法精密度良好，见表1。
表1 血清PGAM精密度评价 U/LPGAMn8.5sCV%37sCV%74sCV%批间
2.2 PGAM线性范围评价 结果显示PGAM活性在0～140 U/L范围内线性良好。结果见图1。
2.3 回收率试验 平均回收率分别为97.9%和98.4%。稀释试验：实验结果证实，在血清PGAM活性为3～88 U/L范围内线性关系良好。如图2。
2.4 稳定性试验和冻融实验评价 如图3。
结果证明各自保持原值的96.1%、97.8%、97.6%。结果表明经3次冻融循环不影响人血清PGAM活性的测定，见表2。
2.5 正常参考值范围 结果经统计学处理求出平均值=41U/L，标准差s=2.8，取95%可信区间±1.96 s，结果正态分布，PGAM医学参考值范围是：（41±5.5）U/L （35.5～46.5 U/L）。表2 血清PGAM冻融实验 U/LPGAM活性冻融次数
2.6 PGAM在心肌梗死与其它酶的变化比较 在心梗发作后2 h内，AST、ALT、LDH、CK、CK-MB、PGAM都在正常范围内。而2～12 h内，除ALT外其它酶活力呈一过性升高，PGAM明显升高。 12～72 h内LDH仍保持高值外其它酶下降趋势，见表3。
表3 血清PGAM在心肌梗死中与其它酶变化比较 U/L测定项目正常参考值&<2 h3～12 h12～72 hT-PGAM41±539±153480±234131±89AST23±1719±4212±150152±108ALT22±1718±740±2146±22LDH300±100290±46985±5701353±532总CK95±6597±482589±18841218±1025CK-MB11±411±5169±10358±44
2.7 PGAM在脑血管意外急性期与其它酶的比较 脑血管意外发作2 h内，PGAM 明显上升，LDH CK活性也有上升。2～12 h及12～72 h内，PGAM 总活性上升后出现下降倾向。在此期间PGAM 总活性的变化与心肌梗死的改变有明显特征性的差别，见表4。 表4 血清PGAM在脑血管意外急性期与其它酶比较 U/L测定项目正常参考值
3 讨 论
综上所述，PGAM 作为糖酵解途径中的一种二聚体酶。普遍存在于多种组织中，血清内含有丰富的PGAM；与CK情况相反，以BB型为主，占90％，MM 型较少。临床实验室在建立或引进应该对检测方法的的基本性能进行评价，以掌握方法的特征，判断能否满足使用要求，在方法学上：本动力学检测血清PGAM活性方法按照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准进行评价。在精密度上，低值血清对精密度的要求最高，如果在低值水平就可以获得良好的精密度，其它浓度水平的检测结果就更为可靠本实验的低值时的精密度比较好，因此评价业较高。线性范围是反映方法性能的重要指标，测定线性范围是指系统的最终输出值（浓度或活性）与被分析物质的浓度或活性成比例的范围，常规方法应该具有较高宽的分析范围一般应覆盖健康人参考区间和临床可能出现的高值，本实验线性范围为(0～140)U/L，线性范围比较好，适合常规检测。回收实验的目的是测定系统的比例误差，将精密配制的分析物纯度标准物溶液加入样品只能够，为待测样品，而原样品中加入同量的无分析物的基础溶液作对照样品，用待测方法进行分析，理想的回收率为100%，一般以（100±5）％为合格，本实验的平均回收率分别为97.9%和98.4%，说明结果良好。所以本检测方法可在临床生化自动分析仪上应用。在临床应用上：急性心肌梗死时PGAM活性上升情况发生在6～12 h，PGAM 总活性可一过性升至正常的9倍；脑出血发作后，PGAM的活性在2 h内即可上升，然后下降。当心肌梗死早期，释放的PGAM 量少。PGAM属正常。心肌释放量大时，PGAM明显下降。PGAM 可作为心肌释放酶，用于诊断心肌梗死，判断预后，在临床应用有一定价值；另一方面，脑出血时PGAM 变化特点与心肌梗塞有明显不同。现有的脑出血生化指标不多，所以动力学发测定PGAM活性有助于临床上的鉴别诊断。
参考文献
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