作者：李晓珩，沈秀微，庄秀秀，胡国新，葛仁山
【关键词】 环境激素;甲氧滴滴涕;生殖系统;毒性;综述文献
近年来，在食品和饮用水中不断检测到农药的残留，其中一些农药，如有机氯农药已经被证明对人体具有致癌性和干扰内分泌系统的作用。我国是农药大国，现在使用的农药中有机氯农药占了很大的比例。经常使用的有机氯农药有DDT、六六六和DDT的类似物甲氧滴滴涕(MXC)、乙滴涕等。作为DDT的结构类似物， MXC的生物活性范围与DDT大体上相同。由于其在体内脂肪中积累或分泌到乳汁中的趋向较小，甚至没有，因此逐渐成为DDT的代替物，广泛使用于蔬菜和果树虫害的控制。但是，近年来发现，MXC半衰期较长(&>6个月)，降解困难，在环境中有累积效应，对土壤和水域中的非靶标生物比如鱼类和水产品类都有一定的影响。MXC主要通过食物链进入人体。MXC急性中毒可以造成典型的有机氯中毒症状：易激惹性，肌肉震颤，随之出现阵发性、强直性抽搐，直至死亡。长期慢性中毒可造成神经行为改变，乳腺癌，肝脏形态功能损害，以及生殖系统毒性。所以MXC近年来受到社会各界的广泛关注，逐渐成为研究的主要热点之一。现将目前国外MXC的毒性研究进展综述如下。
1 MXC的一般理化特性
MXC又称甲氧氯，化学名称为l，1，1-三氯-2-2-双(对-甲氧苯基)乙烷[1，1，1-tfichloro-2-2-bis(p-methoxy phony1)ethane]，分子式Cl6Hl5Cl3O2，摩尔质量为345.65。为无色晶体(原油为灰色粉末)，熔点89 ℃(原油77 ℃)，蒸气压很低，密度1.41(25 ℃)，水中溶解度0.1 mg/L(25 ℃)，醇、氯代烃类、酮类溶剂、植物油和二甲苯中溶解度440 mg/kg(22℃)，对氧化剂和紫外光稳定。与碱反应，特别是有催化剂条件下反应迅速，失去氯化氢，但比DDT慢，曝光下颜色变成粉红色或棕褐色。同时，其代谢产物OH-MXC和2-2-双(p-羟基苯)-1，1，1-三氯乙烷(HPTE)比MXC具有更有效的雌激素作用[1]。MXC是一种人工合成的广谱杀虫剂，对人畜毒性低，但在全球范围内造成污染，而且可对身体的各个器官系统都造成不利影响，因而成为关注的焦点[1]。
2 MXC对生殖系统的影响
MXC对生殖系统的毒性研究，主要集中在雄性的生精小管、雌性的生殖系统如卵巢窦状卵泡等部位，对受精卵和胚胎也有一定的毒性作用。
2.1 MXC对雄性生殖系统的影响及其可能的机制
有关MXC的雄性生殖毒性近年来研究较多。特别是运用大小鼠作为动物模型进行的研究[1]。Chapin等[2]研究发现，雌性大鼠产前及产后给予MXC，其子宫重量减轻，新生小鼠数量下降;新生小鼠出生后7 d内给予MXC，雄性小鼠肛门生殖器间距离(AGD)未见显著变化，但其包皮分离时间明显延迟，抗体中蚀斑形成细胞数量明显减少，动情周期紊乱，睾丸、附睾、精囊、前列腺重量显著下降，附睾内精子计数及精子运动能力均下降;经口给予出生7～42 d的雄性小鼠MXC，处死后固定睾丸，切片观察Sertoli细胞核，发现Sertoli细胞核的体积与数量有明显的剂量依赖关系，Sertoli细胞数量的减少与睾丸重量和附睾精子数量的减少密切相关。因此，作者认为，MXC能使围产期和幼年期雄性大鼠的Sertoli细胞数量减少，大鼠成年后精子生成的能力受到抑制[3]。Latchoumycandane等[4]发现，雄性大鼠口服MXC，附睾、精囊、前列腺的重量下降，超氧负离子和过氧化氢的数量有所增加，谷胱甘肽还原酶的活性降低，但在睾丸中的脂质过氧化作用却显著增加。结果表明，MXC能通过减少抗氧化物酶，增加脂质过氧化作用，诱发氧化应激反应，从而产生雄性生殖毒性。此外，将口服50 mg/kg MXC的大鼠解剖发现，睾丸内StAR蛋白含量相继减少，△53β-羟化类固醇脱氢酶(3β-HSD)和△517β-羟化类固醇脱氢酶(17β-HSD)的活力在6～12 h时显著增加，但雄激素结合蛋白(ABP)含量却明显下降。结果显示，MXC对睾丸中类固醇的生成有影响，而过氧化氢酶可能介导着这些毒性效应。
2.2 MXC对雌性生殖系统的影响及其可能的机制
MXC在体内具有雌激素活性，大量的研究表明其与雌激素(E2)的作用类似，能在实验动物的生殖系统中起作用。在去除卵巢的动物中引起亲子宫反应，在妊娠期慢性暴露于MXC的啮齿类动物可以产生发育和生殖毒性，包括胚胎毒性、性早熟、生育力减弱、卵巢萎缩。 进一步的分子研究表明MXC和E2都可以通过影响表皮生长因子受体、子宫过氧化物酶等调节子宫蛋白活性[1]。Chapin等[2]发现，母鼠口服MXC，其雌性子代阴道开口的时间提早，子宫发育不良，乳头数量明显减少，动情周期分泌的促性腺激素和黄体激素显著减少，妊娠和分娩率降低。还有实验证明，新生大鼠出生后21～35 d口服50 mg/kg的MXC，其动情周期缩短，但动情周期性变化模式还不明确，需要进一步的研究[5]。
Gupta等[6]把39日龄的CD-1小鼠体内的窦状卵泡放在MXC(1～100 mg/mL)中培养发现，MXC抑制窦状卵泡的生长，诱导卵泡闭锁;通过定量RT-PCR发现，Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶(CAT)的表达均被抑制。不仅仅是啮齿类动物，在灵长类动物身上，也存在这样的现象。MXC以及MXC的代谢产物，OH-MXC和HPTE，均可抑制狒狒窦状卵泡的生长，增加窦状卵泡的闭锁率;实验还证明，灵长类动物的窦状卵泡对MXC的敏感性要高于啮齿类动物[7]。Miller等[8]从野生型(WT)、Bcl-2过表达(Bcl-2OE)、Bax缺失(BaxKO)这三种小鼠中分离得到窦状卵泡，分别放在DMSO(对照)和MXC(1～100 mg/mL)中培养96 h，研究其作用机制时发现，MXC能直接通过Bcl-2蛋白和Bax蛋白的途径抑制部分卵泡的生长，通 过Bcl-2蛋白的途径部分增加卵泡的闭锁。
新生小鼠腹腔注射0.1、0.5、1 mg MXC 2～4个月后，口服妊娠母马的血清促性腺激素10 IU和人体毛膜促性腺激素10 IU;15～20 h后解剖观察卵巢的形态发现，MXC低剂量组小鼠的卵巢表现正常，2个月后和对照组的小鼠排卵的个数相同;高剂量的MXC引起小鼠卵巢萎缩，但在注射促性腺激素之后，萎缩的卵巢还能排出卵子。但卵母细胞恢复的个数与时间和剂量呈反比，实验4个月时，卵母细胞的数量显著下降。结果表明，MXC能引起新生小鼠成年后排卵速度降低和卵巢功能障碍[9]。此外，Golub等[10]用青春期的雌性猕猴做实验模型，分别给予25、50 mg·kg-1·d-1的MXC和己烯雌酚(DES)0.5 mg·kg-1·d-1，发现MXC和DES都能引起早熟，皮肤红肿，乳头发育迟缓，血清雌激素活性增加。停药8个月后，超声检查发现，子宫的大小并没有收到外源性雌激素的干扰，但卵巢出现囊肿。进一步的分子研究表明，MXC可能通过ER-α和ER-β起作用。实验还发现，50 mg·kg-1·d-1的MXC还能引起雌性恒河猴股骨数量和密度的降低[11]。另有研究发现MXC还能对卵黄蛋白原(VTG)产生影响。分离的转基因品系鲤鱼肝细胞暴露于MXC和雌酮(E1)中，8 d后用间接酶联免疫吸附测定法测定VTG含量。结果发现，MXC引起VTG产生的含量是E2引起的4倍，卵黄生成量是E1引起的2倍，但MXC没有引起显著性差异。MXC对卵黄蛋白原的影响结果不同是由于剂量还是物种差异引起的还有待进一步研究。
2.3 MXC对胚胎发育的影响
有关MXC对胚胎毒性的影响，研究得较早，使用的动物模型也较多，比如早在1975年，Bookhout等[12]就利用泥蟹和蓝蟹为对象，研究了各种不同浓度的MXC对其胚胎和幼虫存活率的影响，从而确定了MXC的急性和亚急性毒性的浓度。1998年，Mwatibo等[13]把受精10 min后的海胆胚胎暴毒于MXC中30 min，然后观察MXC是否对海胆的生长发育造成影响，并进一步研究细胞色素P450的变化。此外，Fort等[14]观察了MXC对非洲有爪蟾蜍的影响，评估表明，成年雌性有爪蟾蜍呈促排卵状态，各种浓度的MXC对雄性或雌性均有影响。雌性卵巢重量和卵母细胞数及雄性睾丸重量和精子数均呈剂量依赖性减少。 MXC在卵巢累积的程度比睾丸差。无论是雌性还是雄性暴露MXC后，交合频率、受精率、胚胎的成活率均受影响，但对雌性的影响程度较雄性轻。总的来说，结果表明机体在生殖和变性阶段对MXC最敏感，早期胚胎发育阶段敏感性最低。
MXC还能改变成年雄性鹌鹑的性行为。实验表明，亲代(P1)和子代(F1)，分别口服MXC 0、5和10 ppm，子二代(F2)做对照组。结果显示，MXC能改变雄性鹌鹑的性行为、下丘脑儿茶酚胺类和血清类固醇激素的含量;此外，低浓度和高浓度的MXC均能影响F1和F2代的生育[15]。Amstislavsky等[16]在小鼠妊娠第2天皮下注射雌激素或5.0 mg MXC，发现经MXC处理后胎鼠死亡率高;雌激素和MXC均不会改变出生性别比例;但胎仔数减少。胎鼠出生后21 d，在前植入期暴露于雌激素或MXC的雄性表现出肛门生殖器间距离(AGD)缩短，MXC组变化显著。但MXC组雌性子代AGD未受影响，但是雌激素组与对照组比较，AGD变长。前植入期给予雌激素或MXC能够加速性成熟，如雌性在断奶后阴道就呈现显著开放状态。说明在前植入期暴露于MXC或雌激素对子代对其发育产生长期性的影响。
3 MXC对机体其他方面的影响
卵巢表面上皮(OSE)对激素和内分泌干扰物质有迅即的感应现象，Symonds等[17]基于这一现象，假设OSE能通过基因表达调节MXC的I相代谢对其造成影响。分离小鼠的OSE细胞，将其置于DMSO(对照组)、MXC和抗雌激素ICI 182 780中培养。14 d后，定量RT-PCR检测细胞色素P450(CYPs) 1A1、1B1、2C29和1A2。结果表明，MXC不改变CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1的表达，但能引起CYP2C29表达的增加，且能被ICI 182 780所拮抗。此外，MXC不影响ER-α的表达，提示MXC能通过ER来调节OSE酶的表达。MXC可以减少子宫内对妊娠有支持作用的蜕膜细胞的反应。Hoxa10是雌激素调节基因，对蜕膜反应有重要的调节作用，对妊娠是必须的。Fei等[18]阐明了MXC可以通过干扰Hoxa10的表达对子宫产生影响。MXC对小鼠有亲子宫作用，可以增加子宫的重量和上皮细胞的高度。子宫内Ishikawa细胞接触MXC，可以诱导Hoxa10的表达。雌二醇能够促进雌激素受体与Hoxa10雌激素反应单元(ERE)结合的能力;但是，MXC干扰了E2/ER/ERE复合物的形成，并能减弱ER与ERE的结合。体内实验表明，MXC抑制E2对Hoxa10的表达。新生小鼠接触MXC导致Hoxa10表达的瞬时抑制，并且对小鼠产生持续的抑制作用。其作用机制是内分泌干扰物通过持续改变生殖道基因的表达，从而产生持续的生殖道缺陷。
还有研究MXC对体内一氧化氮(NO)和细胞致炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)生成的影响，以及研究在小鼠巨噬细胞中的分子作用机制。MXC诱导巨噬细胞中NO和致炎细胞因子的生成与表达，并且呈现一定的量效关系。已证明，NF-κB位于iNOS和致炎细胞因子基因的启动子中。瞬时表达和电泳迁移率变动分析显示，NF-κB转录因子介导MXC诱导iNOS和致炎细胞因子表达水平的增加。此外，MXC诱导ERK1/2和p38 MAPK的快速磷酸化，表明MXC刺激NO和致炎细胞因子的生成，并且能够通过NF-κB的转录激活，ERK1/2和p38 MAPK的快速磷酸化，上调NO和致炎细胞因子的表达作用。总之，已证明MXC能够引起炎症，这在之前的免疫调节活性研究中是没有阐明的[19]。除了鼠之外，Ortiz-Zarragoitia等[20]还研究了外源性雌激素对斑马鱼肝过氧化物酶增生的影响。成年斑马鱼各暴毒于E2和MXC各15 d。结果表明，这些物质都能引起肝过氧化物酶体表面积和细胞数量密度的显著增加，过氧化物酶体β-氧化酶脂酰辅酶A过氧化酶(AOX)活性的增加。其中，DBP、MXC和E2引起的过氧化酶密度的增加与AOX活性的增加有一定的相关性。这些物质没有引起睾丸形态学上的变化，但是E2和EE2能引起生精细胞的增殖，MXC、OP、EE2和E2能引起卵黄蛋白原(VTG)水平的显著增加。此外，MXC、OP和EE2引起的VTG增加与AOX活性有显著的相关性，这表明，这些外源性雌激素的雌激素效应与肝过氧化酶的增生有关。实验还证明，高剂量的MXC(10 mg/kg)能引起新生小鼠下颌骨大小的改变，波动性的偏位向定向偏位的转变。抑制脑内线粒体的呼吸，加速了磷酸化反应[21]。诱导垂体和子宫血管生成因子组织学的改变[22]。
4 复合染毒新进展
随着农业的发展，环境污染越来越严重，环境激素污染严重威胁着人类和动物界的生存和繁衍，是21世纪人类面临的巨大挑战。由于环境激素种类繁多，人类可能同时受到多种污染物的影响，故近年来，科学家们将研究的目标转向了复合染毒，希望通过复合染毒，了解不同类型环境激素类物质的作用方式，模拟其对人类造成的危害，对人类健康影响的研究提供科学的依据。Halldin等[23]分别给予鹌鹑胚胎150μg/g的MXC、150μg/g 的Clophen A50(CA50)，以及150μg/g MXC、10μg/g多氯联苯(PCB)、Clophen A50(CA50)的混合物。结果显示，混合物给药引起的雄性鹌鹑性行为比单独给药时有显著的减退效应，这可能是由于CA50引起生物转换酶的增加使得MXC在体内转变成为更具有雌激素效应的代谢产物2，2-二(p-羟基苯)-1，1，1-三氯乙烷(HPTE)所造成的。Thorpe等[24]评估了雌激素样作用的化学二元混合物质对虹鳟鱼体内卵黄蛋白原(VTG)含量可能的毒性效应。E2、4-壬基苯酚(4-tertnonylphenol，NP)和MXC单独暴毒，或者其中的两者混合各暴毒14 d。结果显示，E2，NP和MXC都能引起血清VTG含量的升高;E2:NP(1:1 000)，E2:MXC(1:1 000)和NP:MXC(1:1) 固定浓度配比所得到的量效曲线和单个化合物的量效曲线相比较，使用剂量相加模型。结果表明，NP和E2可能通过相同的作用机制，即诱导VTG的合成，产生作用;而MXC则可能是通过在体内的代谢物质HPTE来起作用的;但还不能确定MXC和NP的混合物是否通过剂量相加模型起作用，需要进一步的实验证明。此外，将苯并芘和14C-MXC混合物暴毒于鲶鱼上。7 d之后，用萃取和层析色谱分析鱼的血液和组织，结果表明，肝、肝线粒体、肌肉、内脏脂肪组织、脑和性腺中都含有不同浓度的MXC、OH-MXC和HPTE;苯并芘和14C-MXC混合物能够促进MXC在体内的消除作用[25]。
也有利用人乳腺癌细胞系(MCF-7)的报道基因，来评估三元化合物相互之间的作用的研究[26]。将合成类的杀虫剂MXC、o，p-DDT和狄氏剂混合在一起，低剂量、高剂量分别暴毒，结果用非线性混合模型进行测试，考察混合物质累积毒性是否与其单个作用时的作用相一致。结果表明，MXC、o，p-DDT和狄氏剂混合物的效应在低剂量(P =0.506)和高剂量(P =0.065)时，与单个物质的作用结果差异没有显著性。复合染毒是近年来研究的一个热点，也是一个容易被忽略的盲点。由于环境激素类物质容易在土壤和水域中残留累积，故现在的很多研究主要集中在土壤和水域中，比如鱼类等低等生物;但对陆地上的生物，比如鼠、兔，甚至人类等高等动物研究甚少，所以复合染毒是一个新兴的研究方向，实验的结果将指导人类合理使用农药，控制环境中污染物的浓度，对人类的生存和繁衍有重要的意义。
5 展望
MXC是目前广泛应用的有机氯杀虫剂，可通过多种毒性机制对身体的各个部位发挥作用。此外，由于各种不同类型的环境激素类农药在环境中大量存在，使得人们可同时接触多种环境激素，因此还存在与其他化合物之间的联合作用，目前虽然已经有研究混合毒物对生物的联合毒性，但是这种联合作用的效应还不清楚，其作用机制也不十分明确;此外，由于MXC主要残留于土壤和河流之中，且半衰期长，降解困难，在环境中造成了一定的富集作用，增加了MXC对水体非靶标生物如鱼类等的毒性作用;其初级代谢产物HPTE是ER-α的激动剂，ER-β的拮抗剂[27]，这就增加了其对机体作用的复杂性和研究难度。因此有必要建立统一、合理、灵敏的检测方法，并在此基础上扩大对人类健康影响的研究，结合实验研究和流行病学调查资料作出综合评价。
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