【摘要】 目的 探讨大鼠脊髓损伤后给予髓磷脂相关生长阻逆蛋白抗体(IN-1)以及和神经营养素3(NT-3)联合作用后神经元中丝蛋白（neurofilaments， NF）的表达有无变化。方法 健康Sprague-Dawley（SD）大鼠18只，平均随机分为损伤对照组、IN-1组及IN-1和NT-3联合作用组。各组分别在术后28天取材行HE染色、免疫组化染色检测NF表达的变化。结果 联合组NF染色灰度值明显小于其他两组（P&<0.05或P&<0.01）。结论 IN-1及联合应用NT-3后可以促进脊髓损伤后轴突的再生，促进运动功能的恢复。
【关键词】 脊髓损伤 髓磷脂相关生长阻逆蛋白抗体 神经营养因子3 神经元中丝蛋白
Abstract: Objective To observe the changes of neurofilements (NF) in rats with spinal cord injury after treated with myelin-associated growth inhibitor Nogo-A (IN-1) and in combination with neurotrophin3 (NT-3). Methods 18 healthy Sprague-Dawley (SD) rats were randomly allocated to injured control group， IN-1 group， IN-1 combined with NT-3 group. 28 days after operation， samples were collected each group. An HE staining and an immuno-histochemical staining were performed to observe the changes of NF. Results In IN-1 combined with NT-3 group， the gray value of NF was lower than the other two groups (P&<0.05 or P&<0.01). Conclusion IN-1 and IN-1 combined with NT-3 results in increased regenerative sprouting and growth of lesioned spinal cord axons and enhanced rehabilitation of motor function.
Key words: spinal cord injuries; myelin-associated growth inhibitor Nogo-A; neurotrophin3; neurofilament
脊髓损伤是世界性的医学难题，国内外学者进行了大量的研究，试图通过各种方法来减轻脊髓的损伤，促进脊髓损伤的修复及神经功能的恢复。目前研究较多的是通过一定的干预手段，观察脊髓损伤的修复情况，而神经元中丝蛋白（NF）可以从侧面反映脊髓损伤后轴突再生的情况。本实验通过给予髓磷脂相关生长阻逆蛋白抗体（IN-1）及联合应用神经营养素3（NT-3），观察大鼠脊髓损伤后NF表达的变化，探讨二者对脊髓损伤修复的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 NT-3购自美国Peprotech EC公司，IN-1购自美国Santa公司，NF一抗、NF免疫组化试剂盒购自美国Sigma公司。
1.2 实验动物及分组 清洁型SD大鼠18只（由中南大学实验动物部提供），雌雄不限，体重250～300g，随机分为手术对照组(n=6)、IN-1组（n=6）及IN-1和NT-3联合作用组(以下简称联合组，n=6)。
1.3 动物模型的制作 所有动物首先采用改良Yaksh法［1］，后正中切开大鼠颈背侧皮肤，沿中线分离肌肉，暴露寰枕膜，用尖刀小心切开寰枕膜、硬脊膜和蛛网膜，直到有清亮脑脊液流出为止，然后将外径0.61mm的PE-10聚乙烯导管经枕骨大孔顺行插入蛛网膜下腔6.0～6.5cm，达T8上缘水平，依次缝合软组织，将导管牢固固定在伤口周围皮肤。所有动物在麻醉清醒后饲养3天，确定无后肢功能障碍者纳入实验组。参照Brosamle等［2］方法制作脊髓半横断模型，采用水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉。用剪刀剪掉背发，取俯卧位，消毒铺巾，以T8棘突为中心，做长约2cm的纵行切口，显露T7至T9棘突和椎板，在手术显微镜下小心咬除T7～9棘突及椎板，剪开硬脊膜，在相当于T8椎板水平用做好标记的显微剪刀剪断脊髓的后2/3，深度为1.5mm，再用做好标记的11号刀片的尖端部分在损伤的脊髓处来回划动１次，以确保可靠的切割。其中手术对照组通过置管每天注入生理盐水30μl，而IN-1组每天用微量进样器注入IN-1 24μl(0.6μg/μl)，联合组每天注入IN-1 24μl(0.6μg/μl)和NT-3 3μl(1μg/μl)。每天分为早、中、晚３次注射，每次注射完毕后用10μl生理盐水冲管，以保证药物进入蛛网膜下腔，每组连续使用1周。术后人工挤压膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。
1.4 标本的收集和处理 所有动物均分别于术后28天用4％多聚甲醛/0.1mol/L PBS经左心室—主动脉灌注后取出脊髓组织，灌注液中固定12h左右，然后放入30％蔗糖溶液中，待组织沉底在开放冰冻切片机上切片，厚度30μm。
1.5 NF免疫组化染色 NF200染色采用链亲和素－生物素（SABC）法，严格按照试剂盒说明操作（NF200一抗稀释度为1∶2000），DAB显色，脱水，封片，对照以0.02mol/L PBS代替一抗。光镜下观察，有棕黄色染色为阳性。
1.6 图像分析 NF免疫组化染色结果采用德国KONTRON IBAS 2.5全自动图像分析系统，在损伤的头尾两侧，分别取10个视野，以切片的背景调整灰度，测定其灰度值，计算平均灰度值，作为该切片的灰度值。
1.7 统计学方法 计量数据用±s表示，对多组实验数据组间是否存在显著性差异，采用One-Way ANOVA分析；对两组实验数据，采用独立样本的t检验，检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 HE染色 损伤对照组断端间硬膜相互靠拢，损伤区内脊髓的正常结构明显破坏，中央管消失，有灶状坏死，灰质中形成较大空腔，多数神经细胞胞核溶解，坏死灶内有炎性细胞浸润；IN-1组脊髓结构破坏较对照组明显减轻，坏死面积减少，坏死灶内有炎性细胞浸润，神经组织软化灶形成，残存的神经组织内可见少量残存的神经元，神经纤维水肿；联合组损伤区内有细长的多级细胞，新生的轴突呈树状，伸向断端间组织，周围有炎性细胞浸润（见图1）。
2.2 NF免疫组化染色 NF免疫组化染色切片上， NF免疫阳性染色呈棕褐色，在手术对照组可见少量染色阳性纤维，纤维细小，排列方向紊乱；IN-1组NF免疫组化染色可见大量染色阳性纤维，纤维较长，多呈纵向排列，损伤平面头侧可见少量弯曲、不连续的神经纤维向瘢痕方向生长，有少量的纤维生长入瘢痕组织内；联合组则可见更多的染色阳性纤维，在损伤平面头侧可见大量的再生神经纤维，并有较多的纤维长入瘢痕组织内（见图2）。
三组动物中NF免疫组化染色灰度值分析结果显示，对照组与IN-1组及联合组相比差异均有显著性（P&<0.05或P&<0.01），联合组与IN-1组相比，灰度值差异也有显著性（P均&<0.05），见表1。
图1 HE联合组(×10)（略）
图2 NF联合组尾侧(SP×10)（略）
表1 NF免疫组化灰度值（略）
与对照组比较，a:t=2.69，c:t=2.64，P均&<0.05，b:t=5.37，d:t=4.53，P均&<0.01;与IN-1组比较，e:t=2.31，f:t=2.24，P均&<0.05
3 讨论
NT又称神经营养因子家族［3］，是近几年发现的对神经元在胚胎期及成熟发育期存活和发育所必需的一些生长因子，随着分子生物学技术的不断发展，对神经营养因子家族有了越来越深入的研究。它由神经元靶区组织分泌后通过轴浆逆行运输到达神经元或通过自分泌和旁分泌方式作用于神经元，对神经元的结构和功能发挥作用。NT-3是神经营养因子家族成员之一，其在神经系统的发育和分化过程中，在调节神经元活动及神经损伤中以及在非神经系统中都起重要的作用。成熟NT-3蛋白的分子量为13.5KD，在生理条件下主要以二聚体的形式存在，通过与高亲和力受体trkC结合来发挥作用。
Nogo为对神经突再生起抑制作用的髓磷脂蛋白成分，IN-1为nogo的单克隆抗体，它的发现成为脊髓损伤修复的突破性进展，为脊髓损伤的实验性治疗提供了广泛的前景。Schwab等［4］在脊髓损伤后大鼠脑内植入能分泌IN-1的杂交瘤细胞，通过对脊髓皮质脊髓束标记发现，有少量皮质脊髓束轴突能再生1cm左右，且下肢主动活动功能有部分恢复。
NF主要构成神经胞体尤其是神经轴突的细胞骨架框架，是神经元特异中间丝，由神经丝蛋白构成，对于维持细胞的特定形态及多种细胞的生理功能具有重要意义，并且在维护神经元的功能和轴浆运输等一系列与脊髓损伤修复相关的病理生理变化中发挥着重要的作用［5］。根据其分子量的差别，分为3种：68KD、140KD、200KD。目前对正常神经中丝特异结合的单克隆抗体有抗68KD和抗200KD两种。68KD的神经中丝存在于神经细胞的胞体及轴突中，而200KD则存在于轴突中，在胞体中无分布，故在正常情况下只显示轴突，胞体不着色。当脊髓因轴突修复或神经细胞功能改善时，胞体和轴突中开始合成并积聚大量的200KD的神经中丝，这就在形态学基础上反映了所染结构的一个功能侧面。当脊髓损伤后，损伤区内的神经细胞受创伤及继发因素的直接影响出现变性坏死、结构破坏及细胞崩解，失去对创伤的反应能力，而损伤区外的相邻神经元在创伤刺激及多种因素作用下，开始合成及积存NF200，以适应神经再生的需要。有研究表明，脊髓不完全损伤后NF200阳性神经元的数量及神经元胞体和轴索着色的程度与后肢功能恢复情况密切相关［6］，表明NF200染色程度不仅能显示脊髓损伤后神经元的形态，也能反映其功能状态。因此本实验采用抗200KD神经中丝抗体特异性地显示神经轴突。
实验结果显示，对照组损伤的邻近脊髓组织，NF染色呈阳性，纤维细小，排列方向紊乱，表明神经纤维功能状态不良；IN-1组损伤邻近区域，可见大量免疫阳性纤维，纤维较长，多呈纵向排列，说明神经纤维再生功能良好，以合成大量的NF200来适应轴突再生的需要；而联合组NF染色的灰度值与其他两组相比差异有显著性(P&<0.05或P&<0.01)，从侧面反映了本组轴突再生的能力和神经的功能都明显高于其他两组。由此可见，IN-1以及联合应用NT-3都促进了轴突的再生，促进神经功能的恢复。
参考文献
［1］ Yaksh TL， Rudy TA. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space ［J］. Physiol Behav，1976，17(6):1031-1036.
［2］ Brosamle C， Huber AB， Fiedler M， et al. Regeneration of lesioned cortico-spinal tract fibers in the adult rat induced by a recombinant， humanized IN-1 antibody fragment ［J］. J Neurosci，2000，20(21):8061-8068.
［3］ 郭家松.NT-3基因修饰施万细胞与神经干细胞联合移植治疗全横断性脊髓损伤的实验研究［D］.博士学位论文，广州：中山大学，2003.
［4］ Schwab ME， Brosamle C. Regeneration of lesioned corticospinal tract fibers in the adult rat spinal cord under experimental conditions ［J］. Spinal Cord，1997，35(7):469-473.
［5］ 胥少汀，郭世泼.脊髓损伤基础与临床［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2002：205.
［6］ Gimenezy Ribotta M， Menet V， Privat A. The role of astrocytes in axonal regeneration in the mammalian CNS ［J］. Prog Brain Res，2001，132:587-610.