【摘要】 结肠癌在我国的发病率与国外发达国家相比较低。但近年由于饮食结构变化，发病有增加趋势，在消化道肿瘤中仅次于胃癌。RNAi是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导，非编码特异性降解相应序列的小mRNA与封闭性核酸酶调控复合物结合，再与互补目标mRNA配对，阻止相应mRNA表达，从而产生特异的基因沉默。随着RNAi技术的出现和飞速发展，其被应用与结肠癌的发生发展的相关研究和治疗等方面的研究报道逐渐增多，为结肠癌的深入研究提供了新的思路。本文结合文献资料综述对相关研究进展作一综述。
【关键词】 RNAi技术;结肠癌;肿瘤发生发展;治疗
在2004年9月《Nature》第一次出版了RNA干扰(RNAi)相关的文章之后，短短6年内，RNAi在生物学领域掀起了一场革命，产生极大地影响。为其在肿瘤研究与治疗领域提供了更为有效的方法。
1 RNAi的分子基础及机制
1.1 RNAi的分子机制 RNAi的具体机制未明确，但通常认为RNAi包括三个步骤[1，2]：第一步，细胞中的内源性或外源性长链双链RNA(dsRNA)被命名为Dicer的核苷酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)分解为小RNA双链体(包括正义和反义链);第二步，小RNA双链体在RNA解旋酶作用下展开，形成单链，其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC);第三步，活化的RISC在小RNA引导链-载入单链RNA(ssRNA)引导下，识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从ssRNA中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。
1.2 RNAi的分子组成 在不同生物体中，RNAi途径包含不同的蛋白和机制，但它们依然有值得人们关注相似的步骤。在所有已被研究的生物体中，RNAi包括两个主要的成分：小RNA，决定干扰的特异性;Argonaute蛋白，执行干扰。
RNAi以及相关的基因沉默途径起始于有特殊序列的小RNA(约20～30核苷酸)，它们能与转录子的片段互补。小RNA主要包括三种类型：短链干扰RNA(short interfering RNAs，siRNA)、microRNA(miRNA)和PIWI蛋白-作用RNA(piRNA)。简单地说，小RNA主要根据其前体成分进行分型，siRNA和miRNA来源于内源性和外源性dsRNA前体，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成[3]。
1.2.1 siRNAi的分子组成及生物学活性 siRNA是RNAi途径发挥应所必要的重要因子，为长度约在22nt左右的双链RNA，生成需要Argonaute家族蛋白存在，能作用于mRNA的任何部位，但是只能导致靶基因降解，即转录水平后调控。siRNA识别靶序列是有高度特异性，原因是降解首先在相对于siRNA来说的中间位置发生，这些中间的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配会严重抑制RNAi效应。siRNA并不参与生物生长，其原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。
1.2.2 miRNA的分子组成及生物学活性 miRNA，则类似于siRNA，通过和靶基因mRNA碱基配对诱导RISC降解mRNA或阻碍其翻译。在植物、动物和真菌种发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程中起一定作用。PiRNA，与siRNA和miRNA不同，其前体是单链RNAs，其发生并不需要Dicer。
1.2.3 piRNA的分子组成及生物学活性 由于技术的限制，piRNAs的产生和作用机制了解有限，但是已知的是piRNA在Argonaut家族蛋白的PIWI分支体(包括PIWI蛋白、AUB和AGO3)介导下，导致正义和反义转座子转录体的限制依赖性断裂。PIWI或AUB介导的正义转录子的沉默产生正义piRNA，后者与AGO3相互作用，直接沉默反义转录子的转录。沉默产物产生反义piRNAs，后者依次连接到PIWI上，介导正义转录子沉默从而产生正义piRNAs。
1.3 Argonaute蛋白组成及其生物学活性 Argonaute蛋白(AGO)是一类庞大的蛋白质家族，是组成RISCs复合物的重要成员。Argonaute家族蛋白与引导链小RNA相互作用，构成RISCs复合物的核心成分，是RNAi和所有与小RNA介导相关的沉默途径的共同特点[4]AGO蛋白主要包含两个结构域：PAZ和PIWI两个结构域，但具体功能仍未完全清楚。最近研究表明，PAZ结构域结合到siRNA上催化其核内切酶沉默目标mRNA，而在微生物中，PIWI结构域连接piRNAs赋予slicer以内切酶的活性起沉默作用[5，6]。PAZ和PIWI两个结构域，对于小RNA和目标mRNA相互作用，从而导致目标mRNA的切割或者翻译抑制过程，是必不可少的.同时，不同的AGO蛋白有不同的生物学功能。如在人类RNAi中，AGO2“筹划”了RISCs对于目标mRNA的切割过程;而AGO1和AGO3则不具备这一功能。
此外，值得人们关注的是RNAi具有放大效应，是指siRNA不仅可引导RISC切割目的mRNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以目的mRNA为模板合成新的dsRNA，而新的dsRNA再次由Dicer酶识别并切割，形成新的siRNA再次作用于目的mRNA，反复循环，使RNAi的作用进一步放大，最终使mRNA降解，抑制相关基因的表达。由于这一效应，RNAi具有高效性，即相对很少量的dsRNA就能完全抑制相关基因的表达。
2 RNAi在大肠癌研究领域的应用
2.1 RNAi在大肠癌的发生研究方面的应用 研究已经证实从大肠正常粘膜上皮发展到大肠腺瘤，最后到大肠癌是一个多步骤、多基因的发展过程。部分基因及其表达蛋白已经被证实在大肠癌发生发展中起重要作用，如APC、p53等，但不能完整的解释大肠癌整个发生发展过程。Y Yu等为研究人类结肠直肠腺瘤LoVo细胞中mdm2基因的生物学功能，用mdm2siRNA转染入LoVo细胞内，发现mdm2siRNA降低mdm2 mRNA和蛋白的水平，抑制LoVo细胞的增殖以及裸鼠体内肿瘤的生长，从而确定mdm2基因在结肠腺瘤发展到结肠癌的发展中有至关重要的作用[7]。而已经发现多年的c-myc癌基因是myc基因家族的重要成员之一，c-myc基因既是一种可易位基因，又是一种多种物质调节的可调节的基因。研究表明其不仅与细胞增殖、分裂、凋亡有关，也与多种肿瘤的发生发展有关，如乳腺癌等[8]。X Zhang等[9]应用RNAi技术沉默人类结肠癌细胞HT-29的c-myc基因，抑制其蛋白表达后发现c-myc基因沉默后HT-29细胞株在体内外增殖都受到抑制作用，证实c-myc基因与结肠癌的发生有密切关系。不仅如此，随着RNAi技术的运用，越来越多的基因已经被研究在结肠癌发生中的作用，如肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer-1，DLC-1)、RCK/p54、EphA2基因等[10～12]。从肿瘤事件的源头，为结肠癌的基因治疗(诊断)提供了新的依据。
2.2 RNAi在大肠癌的转移机制方面的应用 结肠癌的侵袭转移是难以治愈的根本原因，也是最终导致患者死亡的主要原因之一。在淋巴道转移、血行转移和种植转移这三种转移方式中，淋巴道是结肠癌最常见的转移途径。有无淋巴结转移。转移的多少或远近等信息也是判断患者预后的重要指标，直接影响到患者的生存期。但其肿瘤转移的具体机制目前仍不十分清楚。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种整联蛋白和CD44受体的配子，与多种肿瘤的转移密切相关。然而，OPN介导结肠癌转移的机制尚未明了。PhilipY.Wai等通过siRNA沉默鼠结肠腺癌细胞株CT26的OPN基因成功建立pS-OPN-A4细胞株后，发现在体外肿瘤细胞的运动性和侵袭力降低，但增殖力没有明显变化;在BALB/c鼠体内，对比CT26野生型细胞株，实验组平均肝脏质量减少50.4%(3.79±1.49g：1.88±1.34g，P=0.009)，只有18%的实验组的肝脏表面有超过20个转移性小结。实验表明RNAi稳定减少CT26肿瘤细胞OPN的表达，并通过降低肿瘤细胞的运动性和侵袭力限制了CT26结肠癌细胞的转移[13]。这为今后结肠癌转移的阻断治疗提供了新的思路及依据。
3 RNAi在治疗领域的应用
对于中晚期结直肠癌患者，最主要的治疗手段是化疗，而化疗效果却不尽人意，导致化疗失败的一个主要原因就是肿瘤耐药性的出现[14，15]。
近年来人们对肿瘤的耐药机制进行了大量研究发现，多药耐药现象的发生发展机制极为复杂，肿瘤细胞的遗传性和生化特性发生复杂的变化，导致肿瘤细胞通过不同的机制对药物产生耐药，是有关肿瘤MDR机制之一，其中包括多药耐药基因(multidrugresistance1，MDR1)的发现[16]。实体瘤对化疗药的低反应与MDR1基因的表达水平有关，应用siRNA技术抑制MDR1基因表达，发现随着MDR1和与耐药相关糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的mRNA的抑制，通过阿霉素和长春新碱在人类结肠癌细胞320DM的蓄积，增强化疗药的细胞毒性增加。从而为治疗MDR1/P-gp-依赖性多药耐药性的肿瘤提供了一种新的方法[17]。
然而针对这些耐药机制所设计的治疗方法，尽管在体外研究中效果显著，但在临床上却难以奏效，特别是对实体瘤的治疗更是令人失望。这提示体内实体肿瘤作为一个细胞集体，其生物学特性和对药物的敏感性与体外单层培养的肿瘤细胞有着明显的差异。体内存在的实体瘤是一个三维的细胞群集体，因此，临床上实体瘤的耐药机制更为复杂[18]。通过对多种肿瘤的耐药性研究发现肿瘤细胞的群集耐药现象广泛存在，如乳腺癌、卵巢癌等[19，20]。在随后的很多研究证实透明质酸对多种体内移植瘤及多细胞球有药物增敏作用，证实细胞间粘附是肿瘤群集耐药产生的基础。所以。作为最重要的一类粘附分子的整合素家族成为肿瘤多药耐药性的研究热点。有学者建立结肠癌HT29多细胞球培养模型，验证HT29细胞群集耐药性存在后，应用RNAi沉默整合素信号通路上重要因子ILK的基因表达，检测ILK对结肠癌细胞HT29的增殖、凋亡及群集耐药的影响，探索肿瘤多药耐药性机制的新思路。
4 RNAi的优缺点和应用前景
RNAi具有特异性强、高效性、选择性，此外，还有可传播性、可遗传性、稳定性较强、高穿透性和操作较简单等优点。凭借这些优势，RNAi已经逐步代替基因敲除成为基因水平研究的新方法。但是RNAi在临床应用上仍面临不少问题：其高特异性决定着即使单个碱基的错配即导致RNAi效率降低，siRNA导入载体的方法效率偏低，及RNAi技术在体内使用的安全性有待考证。
虽然存在一些问题，这并不影响RNAi技术的进一步发展及应用。RNAi在基因水平的应用，表明其在结肠癌发生发展及治疗领域中广阔的应用前景。随着RNAi技术在结肠癌研究中的深入和全面，必将结肠癌的早期发现、逆转以及晚期治疗等带上新的阶梯。
参考文献
[1] Meister G，Tuschl T.Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA[J].Nature，2004，431：343～349.
[2] Tomari Y.Zamore P.D.Machines for RNAi[J].Genes Dev，2004，19：517～529.
[3] Bernstein，E.，Caudy，A.A.，Hammond，S.M.&& Hannon，G.J.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature，2001，409：363～366.
[4] Hutvagner G.&& Simard M.J.Argonaute proteins: key players in RNA silencing[J].Nature Rev.Mol.Cell Biol，2008，9：22～32.
[5] Brennecke，J.et al.Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila[J].Cell，2007，128：1089～1103.
[6] Gunawardane，L.S.et al.A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5’end formation in Drosophila.[J] Science，2007，315：1587～1590.
[7] Y Yu，P Sun，LC Sun，et al.Downregulation of MDM2 expression by RNAi inhibits LoVo human colorectal adenocarcinoma cells growth and the treatment of LoVo cells with mdm2siRNA3 enhances the sensitivity to cisplatin[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，339(1)：71～78.
[8] CHIV.DANG.c-Myc target gens involved in cell growth，apoptosis and metabolism.Molecular and cellular biology[J].Jan，1999:1～11.
[9] X Zhang，YL Ge，and RH Tian.The knockdown of c-myc expression by RNAi inhibits cellproliferation in human colon cancer HT-29 in vitro and in vivo[J].Cell Mol Biol Lett，2009，14(2)：305～318.
[10]Y Jin，X Tian，Y Shang，et al.Inhibition of DLC-1 gene expression by RNA interference in the colon cancer LoVo cell line[J].Oncol Rep，2008，19(3)：669～674.
[11]F Lin，R Wang，JJ Shen，et al.Knockdown of RCK/p54 expression by RNAi inhibits proliferation of human colorectal cancer cells in vitro and in vivo[J].Cancer Biol Ther，2008，7(10)：1669～1676.
[12]RY chen，SS Li.Retrovirus-mediated RNA inhibition of EphA2 gene expression in colon adenocarcinoma HCT-8 cells[J].Zhonghua，Bing Li Xue Za Zhi，2006，35(2)：101～105.
[13]Philip Y.Wai，Zhiyong Mi，Hongtao Guo，et al.Osteopontin silencing by small interfering RNA suppress in vitro and in vivo CT26 murine colon adenocarcinoma metastasis[J].Carcinogenesis，2005，26(4)：741～751.
[14]Lindgren M，Rosenthal-Aizman K，Saar K，et al.Overcoming methotrexate resistance in breast cancer tumour cells by the use of a new cell-penetrating peptide[J].Biochem Pharmacol，2006，71(4):416～425.
[15]Kerbel，Robert S.A cancer therapy resistant to resistance[J].Nature，1997，390(6658):335～336.
[16]Johnstone RW，Cretney E，Smyth MJ.P-glycoprotein protects leukemia cells against caspase-dependent，but not caspase-independent[J].cell death.Blood，1999，93(3):1075～1085.
[17]Z Xia，Z Zhu，L Zhang，et al.Specific reveral of MDR1/P-gp-dependent multidrug resistance by RNA interference in colon cancer cells[J].Oncol Rep，2008，20(6):1433～1439.
[18] DeClerck YA.Interaction between tumor cells and stromal cells and proteolytic modification of the extracellular matrix by metalloproteinases in cancer[J].European Cancer，2000，36(10):1258～1268.
[19]Teicher BA，Herman TS，Holden SA，et al.Tumor resistence to alkylating agents conferred by mechanisms operative only in vivo[J].Science，1990，247(4949):1457～1461.
[20] Frankel A，Buc km an R，Kerbel RS.Abrogation of taxol-induced G2-M arrest and apoptosis in human ovarian cells grown as multicelluar tomor spheroids[J].Cancer Res，1997，57(12):2388～2393.