【摘要】 大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机制相当复杂，其中以产生修饰酶为主，近年来对其研究较多，尤其是分子水平的研究取得了一些进展。本文对三种主要修饰酶即氨基糖苷磷酸转移酶、氨基糖苷乙酰转移酶、氨基糖苷类核苷转移酶的作用底物、作用位点、常见耐药细菌、编码基因等进行了综述。
【关键词】 大肠埃希菌；氨基糖苷类修饰酶；耐药机制
大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药的分子机制主要有以下五种［1-5］：（1）细菌产生一种或多种修饰酶，使进入细菌胞内的抗生素失去生物活性；（2） 抗生素作用靶位的改变、核糖体碱基发生变化或与核糖体结合的核蛋白氨基酸发生突变，使抗菌药物无法发挥作用；（3）细菌细胞膜通透性改变，使进入胞内的抗菌药物减少；（4）细菌通过主动外排(active efflux)机制将已进入胞内的药物泵至胞外；（5）细菌产生16SrRNA 甲基化酶［6，7］。
大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素耐药主要是由于产生了一种或多种氨基糖苷类修饰酶（aminoglycoside modifying enzymes，AMEs）。根据AMEs 的修饰活性可分3 类，即乙酰转移酶( aac 基因编码) 、磷酸转移酶( aph基因编码) 和核苷转移酶( ant 基因编码) 。此类酶作用于氨基糖苷类抗生素特定的氨基或羟基，使抗生素发生钝化，降低或丧失对靶位核糖体的亲和力，使细菌在抗生素存在的情况下仍能存活［8］。
1 氨基糖苷乙酰转移酶（aminoglycoside acetyltransferases，AAC）
氨基糖苷类抗生素与核糖体A 位点结合，从而破坏密码子-反密码子解码机制。这样引起了翻译精确度下降，产生了畸形蛋白质。氨基糖苷类抗生素阳离子部分与A 位点结合主要通过16S rRNA。破坏氨基糖苷类抗生素的羟基或酰胺基可以影响其与rRNA 结合，从而引起抗生素耐药性。AAC 有4 种同工酶:AAC(1) 、AAC(3) 、AAC(2′)和AAC(6′) 。它们主要以乙酰辅酶A 作为乙酰基的供体，分别作用于氨基糖苷类抗生素的2-脱氧链霉胺环的1 位和3 位、62氨基己糖环的2′位和6′位。
在大肠埃希菌中AAC(1) 产生对安普霉素、利维霉素、巴龙霉素和核糖霉素耐药。由于这些抗生素未在临床上广泛应用，对该酶的研究不多，其基因也尚未被克隆。
AAC(3)-Ⅰ为窄谱酶，其修饰底物包括庆大霉素、西索米星和阿司米星。AAC(3)-Ⅰa 和AAC(3)-Ⅰb 的编码基因见于临床上30 %的革兰阴性菌。aac (3)-Ⅰa 见于结合质粒、转座子和肠球菌、铜绿假单胞菌整合子的基因盒。近来又发现aac (3)-Ⅰb 与另一个位于铜绿假单胞菌整合子的耐药基因aac (6′)-Ⅰb 融合。
编码AAC(3)-Ⅱa，AAC(3)-Ⅱb 和AAC(3)-Ⅱc的三个aac (3)-Ⅱ基因也已找到，它们的同源性较高。AAC(3)-Ⅱ引起对庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、地贝卡星和西索米星耐药。研究发现85 %的细菌有AAC (3)-Ⅱa 表型，6 %有AAC (3)-Ⅱb 表型［9］。分析aac (3)-Ⅱ基因保守区DNA序列与庆大霉素耐药程度之间关系发现，保守区片断的65A→G和84C→T碱基突变，可相应地使AAC（3）-Ⅱ钝化酶结构域中的第78位氨基酸残基Lys（赖氨酸）→Glu（谷氨酸）和第84位Pro（脯氨酸）→Leu（亮氨酸）。这种突变从单个氨基酸意义上来分析，Lys→Glu可使AAC（3）-Ⅱ钝化酶在相同的pH条件下负电荷数目增多，与带正电荷的氨基糖苷抗生素作用加强，可能使其表现为高耐药。而第84位Pro→Leu改变AAC（3）-Ⅱ钝化酶保守区的二级结构，从而使酶活性发生了变化，但还需要从空间构象上得到证实［10］。Jakobsen L等报道了120株对庆大霉素耐药 的大肠埃希菌的MIC值与耐药机制的关系，其中aac(3)-Ⅳ或ant(2”)-I阳性菌株的MIC值分布为8-64mg/L，aac(3)-Ⅱ阳性菌株的MIC值分布为32-&>512mg/L［11］。
AAC (3)-Ⅲ，AAC (3)-Ⅳ和AAC (3)-Ⅵ不常见。AAC(3)-Ⅲa，AAC(3)-Ⅲb 和AAC(3)-Ⅲc 引起对庆大霉素、妥布霉素、西索米星、卡那霉素、新霉素、利维霉素、巴龙霉素、地贝卡星耐药。Magalhaes ML等学者的研究显示，大肠埃希菌产生的AAC(3)-Ⅳ具有对酰基高度的特异性和对氨基糖苷类药物广泛的特异性，是迄今为止发现的所有AAC(3)中底物特异性最广泛的一种，介导了对庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、安普霉素、地贝卡星、西索米星以及兽用阿布拉霉素的耐药［12］。
AAC(6’ )为广谱酶，它能修饰临床上多数氨基糖苷类抗生素。AAC(6′)-Ⅰ对阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、卡那霉素、异帕米星、地贝卡星和西索米星的耐药，已在细菌中发现该酶的24种亚型。已知的AAC(6′) 中AAC(6′)-Ⅰb 是革兰阴性细菌 菌中最常见的，临床上约70 %的革兰阴性细菌 菌有此活性。编码AAC(6′)-Ⅰb 的基因已在细菌染色体的转座子和整合子中发现，据推测许多微生物的选择性抗生素抵抗是由编码该酶的基因位点变化所致。用DNA 杂交已在革兰阴性菌染色体中发现了一些编码基因，如aac (6′)-Ⅰk，aac ( 6′)-Ⅰf，aac ( 6′)-Ⅰc，aac ( 6′)-Ⅰz.。AAC(6′)-Im在粪链球菌和大肠埃希菌中见到，其基因的DNA 序列与aac (6′)-Ⅰe 有65 %同源性，位于aph ( 2″)-Ⅰb 附近。99位天冬氨酸作为活性位点在AAC(6′)-Ⅰe 的功能中发挥重要作用［13，14］。实验证明aac (6′)-Ⅰm 见于肠球菌和大肠埃希菌中，还见于假单胞菌、克雷伯杆菌、柠檬酸杆菌、沙雷菌和气单胞菌等革兰阴性菌，其耐药基因可以在革兰阳性菌和革兰阴性菌中转移。2006年初，美国学者Robicsek等发现了不仅对氨基糖苷类药物有修饰作用，而且对喹诺酮类药物也有修饰作用的新氨基糖苷类修饰酶aac(6’)-Ib-Cr型［15］。2008年4月，Fihman V等报道在产ESBLs肠杆菌中发现了aac(6’)-Ib-Cr基因［16］。
2 氨基糖苷磷酸转移酶(aminoglycoside phosphotransferases，APH)
抗生素的磷酸化明显影响了其与核糖体A 位点结合能力。编码这种酶的基因常见于多药耐药细菌的R 质粒、转座子和整合子，因而尽管氨基糖苷类抗生素并没有广泛应用，但其耐药性基因也经常在细菌家族中出现。APH是一种利用ATP 作为第二底物，且能磷酸化所有氨基糖苷类抗生素的羟基酶。目前，临床上分离到7 种APH，即APH(3′) 、APH(2″) 、APH(3″) 、APH(4) 、APH(7″) 、APH(6) 和APH(9)［9］。 多数APH(3’) 在3′位修饰羟基，现已经发现7 种不同的APH ( 3′)，即APH ( 3′)-Ⅰ～Ⅶ。APH(3′)-Ⅰ产生对卡那霉素、新霉素、核糖霉素等的抗药性。首先在大肠埃希菌的Tn903 转座子上发现其编码基因aph (3′)-Ⅰ，后来又在肺炎克雷伯菌、肠炎沙门菌、霍乱弧菌和空肠弯曲杆菌等革兰阴性细菌 菌中发现。近来又在革兰阳性菌 条件致病菌棒状杆菌中发现［17］。APH(3″) 和APH(6) 分别修饰链霉素的3″-和6-羟基。编码APH(3″)-Ⅰ有两个基因，aph ( 3″)-Ⅰa 见于产链霉素的链霉菌，aph (3″)-Ⅰb 从革兰阴性细菌 菌的质粒RSF1010 中找到。尽管这两种酶在不同的细菌中发现，它们有50 %的氨基酸相同、68 %同源性。已发现4 个在6 位磷酸化链霉素的酶，编码APH(6)-Ⅰa 和APH(6)-Ⅰb 的基因在链霉素的链霉菌中发现，APH(6)-Ⅰc 常在革兰阴性细菌 菌中见到。编码APH ( 6 )-Ⅰd 的基因也从质粒RSF1010 中找到，而此质粒也存在于APH(3″)-Ⅰb［18］。
3 氨基糖苷核苷酸转移酶（aminoglycoside nucletidyltransferases，ANT）
修饰氨基糖苷类抗生素，这些酶转移三磷酸核苷部分的单磷酸核苷到抗生素的羟基基团上。而所有蛋白质水平研究表明，O-核苷酸转移酶都有广泛地利用各种NTP 的能力，与之相关在细菌细胞中有高浓度的ATP，很可能这些酶是细菌体内唯一的AMP 转移酶。ANT已发现5 种同工酶:ANT (2″)，ANT (3″)，ANT(4′)，ANT(6)，ANT(9) 。其作用机制是利用ATP作为第二底物，通过将AMP 分别转移到2″，3″，4′，6，9 位的羟基上而修饰氨基糖苷类抗生素。ANT(2″)-Ⅰa 引起对庆大霉素、妥布霉素、西索米星、卡那霉素、达佐霉素的耐药。ant (2″)-Ⅰa 基因主要分布在小非结合质粒、结合质粒、转座子、整合子等上。ANT(3″)-Ⅰ主要修饰链霉素的3″位羟基、壮观霉素的9 位羟基而产生耐药性，已发现了至少8 个相应编码基因，广泛见于革兰阴性细菌 菌及革兰阳性菌 菌中的金黄色葡萄球菌和棒状杆菌。ANT(4′) 主要有两个亚型。ANT(4′)-Ⅰa 引起对阿米卡星、妥布霉素、达佐霉素、卡那霉素、异帕米星耐药。已在金黄色葡萄球菌、嗜热杆菌和肠球菌中发现其相应编码基因。与ANT ( 4′)-Ⅰ不同，ANT(4′)-Ⅱa 仅在包括肠杆菌和假单胞菌的革兰阴性细菌 菌中见到，它对阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、异帕米星耐药。ANT(6)-Ⅰ引起对链霉素的耐药性，在欧洲，用DNA 杂交法在80 %肠杆菌和葡萄球菌中发现了其编码基因，同时它们大都还产生其他氨基糖苷类修饰酶，而使细菌对临床上可用的氨基糖苷类抗生素几乎都耐药。2004年，姚蕾等在北京地区临床收集的64株耐庆大霉素大肠埃希菌钝化酶基因型分析结果中报道检出1株仅含有ant(2’’)-Ia基因，另7株ant(2’’)-Ia和ant(3’’)-Ia阳性菌还同时含有aac(3)-Ⅱc或/和aac(6’)-Ib基因［19］。2006年，李智山等从34株大肠埃希菌临床分离株中检出ant(3)-I阳性3株，介导了对庆大霉素和妥布霉素的耐药［20］。
肠杆菌科趋向产生AAC(3)-I、Ⅱ或Ⅳ和AAC(6’)-I，ANT(2’)和APH(3’)。调查显示欧洲肠杆菌科的耐药常与AAC(3)-Ⅱ、AAC(6’)-I、ANT(2’)有关。研究表明耐药类型存在区域性差异［21-23］，AAC(3)-Ⅱ主要在南非流行，AAC(6’)主要在远东出现。
大肠埃希菌对氨基糖苷类药物的耐药性日趋严重，如何控制细菌的耐药性已经成为开发此类抗生素需要解决的首要问题。目前可采取对原有氨基糖苷类抗生素进行改造，开发氨基糖苷类抗生素修饰酶抑制剂，设计双功能氨基糖苷类抗生素等措施来控制耐药性。此外，建立临床合理用药的机制对预防和避免细菌对氨基糖苷类抗生素产生耐药性也十分重要。
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