【关键词】 EGFR表达；基因扩增；CA-SSR1多态性
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是由1186个氨基酸组成的相对分子质量为170×103的膜蛋白，其结构可分为：（1）可与特异性配体结合的细胞外部分；（2） 穿过细胞膜的部分；（3）具有酪氨酸激酶活性的细胞质部分。EGFR与相应的配体结合后，EGFR发生二聚化，引起质膜或胞内酪氨酸残基特异蛋白激酶从无活性转变为有活性形式，从而对作用底物的某些酪氨酸残基进行特异磷酸化。正常表达的表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)信号系统控制着细胞的增殖、生长、分裂、分化；EGF信号系统中任一环节受到干扰或破坏都会使细胞的增殖、生长、分裂、分化从有控制状态转变为失控状态。EGFR在多种恶性肿瘤中呈高表达状态，如：非小细胞肺癌、头颈癌、胃癌、食道癌、结直癌、乳腺癌、膀胱癌等。EGFR的过度表达使肿瘤病人的生存期缩短、对化疗不敏感、乳腺癌病人内分泌治疗失败；随着对EGFR相关信号途径的认识促进了EGFR靶向治疗的发展。因此正确认识EGFR的表达对于制定个体化的治疗方案及估计病人预后有非常重要的作用。
1 EGFR的基因结构
EGFR基因位于染色体7p12。在EGFR基因的5’端调节序列中有一富含CG碱基的启动子，但没有任何保守序列，如TATA或CAAT盒，因此在启动子区域有多个起始位点可以进行转录。EGFR基因有三个增强子:增强子1位于靠近启动子的位置；下游增强子（增强子2）位于内含子1（＋1，788 ～ ＋2，318）中，紧邻CA双核苷酸简单重复序列（CA simple sequence repeat，CA-SSR1）；增强子3位于启动子上游（－1，439 ～ －1，109）。其中增强子2必须依靠增强子3才能发挥调节EGFR基因转录活性的作用。
2 EGFR基因扩增与EGFR表达
基因扩增是指某一些特定亚染色体区段拷贝数的增加，而不包括整个基因组、染色体、臂或大片段染色体区域的扩增。基因扩增通常意味着这些基因的过度表达。尽管EGFR基因扩增的机制还不是很清楚，但近年来关于EGFR基因扩增的资料却在不断的增加。正常或重组的EGFR基因扩增见于约50％的脑胶质细胞瘤及某些鳞癌。
Ekstrand，A.J.等［1］报道在36例Ⅳ级脑胶质细胞瘤（34例原发，2例复发）病人中，发现50％的病人EGFR基因扩增（与2倍体相比）10-110倍，在16例基因扩增的病人中有13例mRNA表达增加（ ≥＋＋，“＋＋＋”表示mRNA表达与“A431”细胞珠相等），免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）结果分析显示EGFR蛋白表达与转录水平有很好的相关性。而Christine H等［2］用DNA微阵列技术研究了33例头颈部鳞癌标本，实验结果统计分析显示mRNA表达与基因复制无关（P=0.37 Student’s test）；为了进一步证实此结果Christine H等用敏感性高的RT-PCR来分析具有代表型性的13例头颈部鳞癌标本（4例基因扩增，3例高异倍体，3例低异倍体，2例3倍体；1例正常即2倍体）。结果显示在荧光原位杂交（Fluorescene in situ hybridization，FISH）实验中，结果阳性与阴性的标本，总RNA的表达无差别（P=0.72 Student’s test）；同样，50例头颈部鳞癌IHC实验结果显示EGFR蛋白表达水平与FISH实验结果无关（P=0.72 Fisher’s exact test）。Christine H等分析以上实验结果可能的原因如下：1.表型遗传机制，比如启动子甲基化导致绝大多数EGFR基因复制无转录活性。在这种情况下，因为遗传压力基因复制增多，但在肿瘤形成阶段却无转录活性；2.基因复制可能被转录，但转录后的RNA异常剪接；异常剪接的RNA不能与cDNA探针结合，导致DNA微阵列及RT-PCR实验结果呈阴性；3.IHC技术在量化评价EGFR蛋白上的局限性。 Hirsch FR等［3］报道了69例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer ，NSCLC)病人：EGFR蛋白表达阴性或低的病例中，有35例（51％）为二倍体，33例（48％）为三倍体，1例为多倍体；相反，46例蛋白表达中等的病例中，有8例（17％）为多倍体或基因扩增；68例蛋白呈高表达的病例中，30例（44％）为多倍体或基因扩增。统计分析显示，蛋白表达与基因复制密切相关（P&< 0.001）。IHC结果评分如下：2倍体：206分；3倍体：213分；多倍体：355分；基因扩增：367分。从以上数据可以看出2倍体或3倍体对蛋白表达没有明显影响，而多倍体及基因扩增对蛋白表达有影响。实验中9％的病人基因扩增，其蛋白全部呈过度表达。Dziadziuszko R等［4］报道66例NSCLC病人的mRNA含量与基因扩增密切相关（P= 0.001），进一步证实了Hirsch FR等［3］的报道。
以上报道证实EGFR基因扩增是EGFR蛋白过度表达的机制之一，特别是在脑胶质细胞瘤中。
3 EGFR基因多态性与EGFR表达
3.1 内含子1双核苷酸CA简单重复序列（CA-SSR1）多态性与EGFR表达 EGFR基因的转录活性主要依靠增强子2和增强子3的共同作用［5］。CA-SSR1（9-23个 CA简单重复序列）位于下游增强子（增强子2）附近。虽然远离上游启动子1000多个碱基，但螺旋结构理论认为：该多态区域在转录方面可能有调节作用。
GebhardtF等［6］用7种细胞珠(SK-BR-3，MCF-7，MKN-7，BT-474，HBL-100，MDA-MB-468，MDA-MB-231）进行体外和体内的转录实验。这些细胞株只有CA-SSR1的多态性，而无其他任何突变，从而排除了基因突变对转录活性的影响。两种实验途径均证实CA重复次数增多转录活性下降；但在体内的转录实验中，MKN-7细胞株（20/20 CA）不支持上述实验结论。针对这一现象，Gebhardt F等推测可能有别的机制能增加EGFR基因的转录活性，并能克服CA-SSR1的转录抑制作用。Gebhardt F等［7］又提出CA-SSR1连接转录因子后能改变DNA的结构。后来Horst Buerger等［8］用酶联免疫吸附实验(enzyme linked im- munosorbent assay，ELISA)定量分析82例乳腺癌标本的EGFR蛋白浓度，资料证实：CA重复次数与蛋白含量呈负相关（Ｐ&<0.05）。杂和子标本，以重复次数较少的等位基因为标准，EGFR蛋白浓度最高的病人CA重复15次 (127.5±47.4 fmol/mg;n= 6)；蛋白浓度最低的病人CA重复18次 (52.0± 59.1 fmol/mg;n=17)；CA重复16次与重复21次相比，后者蛋白浓度下降80％。Horst Buerger等还提出：CA-SSR1的杂和性丢失(loss of heterozygosity ，LOH)也影响EGFR基因扩增与表达。长等位基因的丢失将造成更多的染色体改变，特别是更高频率的基因扩增：长等位基因的丢失与短等位基因的丢失相比，前者造成更多的染色体改变(12.7 ± 6.7 比 6.5 ±3.9; P&< 0.05)及基因扩增频率增加（69％ 比 14％；P&< 0.05)；并且有更高的蛋白表达：比如：16个CA重复等位基因丢失时，蛋白浓度低于22个CA重复等位基因的丢失(36.1± 15.6 fmol/mg;平均，36.3 fmol/mg 比59.18 ± 39.72 fmol/mg ;平均，61.8 fmol/mg)。头颈部肿瘤［7］与乳腺癌［8］资料均提示：CA纯合子比杂合子有更多的EGFR蛋白表达。可能是绝大数纯合子的CA重复次数为16/16，CA重复次数少因此有更高的转录活性。LiuWQ等［9］把“16/16 CA”视为正常，体外实验CA重复增加到21/21，转录活性下降5倍；CA重复下降到12/12，转录活性增加5倍。
尽管也有足够多的资料证明CA-SSR1有重要的转录调节功能：CA重复增多，mRNA及蛋白表达下降；CA重复减少，mRNA及蛋白表达增多。但具体机制尚不清楚，Gebhardt F等［6］和Tidow N等［10］认为CA-SSR1具有高度可折叠性，重复次数越多，折叠越多。有一种抑制转录的蛋白倾向与折叠更多的CA-SSR1的下游结合，结合后引起DNA结构改变而抑制转录。
3.2 其它EGFR基因多态性与EGFR表达 其它常见EGFR基因多态性有：R497K，－216G/T，－191C/A，2607A/G等。在启动子区域－216位点（基本转录因子Sp1的结合点）G被T取代后，启动子活性将增加30％［11］。Nomura M等［12］发现人气管上皮细胞珠“－216G/G”（n=4)的 mRNA含量平均值：1.0（范围 0.5－1.3），蛋白含量：0.97；“－216G/T或－216T/T”（n= 7)的mRNA 含量平均值：1.2（范围 1.0－1.7），蛋白含量：1.24。虽然差别不是很显著，但可以看出G被T取代后，转录活性有上升的趋势。
尽管EGFR基因多态性影响EGFR的表达也得到肯定，但为了更加精确的理解EGFR的表达，还需要进一步的实验证实是否还有别的EGFR基因多态性存在，并分析其与EGFR表达的关系。
4 EGFR基因突变与EGFR表达
常见的EGFR基因突变90%发生在外显子18、19、21；以及外显子2-7的缺失突变(EGFRvⅢ)等。EGFR基因突变常与基因扩增并存从而影响EGFR表达。Ekstrand，A.J.等［1］报道的Ⅳ级脑胶质细胞瘤病例中，62.5％（10/16）基因扩增病例伴随有基因重组。JONAS EKSTRAND等［13］报道的70例Ⅳ级脑胶质细胞瘤中，32例有EGFR基因扩增；基因扩增的病例中有21例伴有EGFR基因5’端 和/或3’端的改变（包括缺失和重组，其中包括外显子2-7的缺失突变），其中5’端的改变较常见。Dziadziuszko R等［14］用RT-PCR技术定量分析了64例NSCLC（50例野生基因型，7例外显子19缺失突变，7例外显子21点突变）的EGFR相关mRNA含量，实验结果为：外显子19缺失突变的mRNA平均值：4.0（范围：0.6－21.6）；野生型的mRNA平均值：1.9（范围：0.2－28.3）；外显子21点突变的mRNA平均值：0.8（范围：0.3－8.5）。从实验结果看外显子19缺失突变的病例有更高的EGFR相关的mRNA表达，但统计分析结果与之相反，mRNA表达与突变无关（P=0.19）。目前尚无外显子18、19、21突变增加EGFR表达的报道。尽管EGFR基因突变常与基因扩增同时存在也得到证实，但是，EGFR基因突变怎样影响EGFR表达？EGFR基因扩增与基因突变是什么关系？还没有确切的答案。
5 转录因子与EGFR表达
调节EGFR表达的转录因子有：Jun蛋白，Fos蛋白，基本转录因子Sp1，拓扑异构酶1等。蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)的激活可引起癌基因c-fos和c-jun的表达，Jun和Fos蛋白经磷酸化修饰后与DNA的增强子结合，从而引起EGFR的表达。拓扑异构酶1［15］以辅助因子的身份参与Jun蛋白转录EGFR相关mRNA的生物过程，拓扑异构酶1含量增加能增强EGFR相关mRNA的转录。拓扑异构酶1抑制剂（喜树碱）治疗肺癌就是建立在该原理之上［16］。
6 临床病理特征与EGFR表达
Hirsch FR等［3］在非小细胞肺癌的报道中指出：分化好的肿瘤EGFR蛋白表达多。不同的组织类型蛋白表达有明显的区别（P&< 0.01)。蛋白表达最多的是鳞状细胞癌（SCC）：平均值299（范围184-400）；细支气管肺泡癌（BAC）：平均值281（范围148-366）。蛋白表达较低的是腺癌：平均值182（范围32－304）；大细胞癌（LCC）：平均值150（范围6－284）。89例SCC的蛋白表达明显不同于非鳞癌（P&< 0.01)：蛋白中度表达的占31％，高表达的占51％。相反，ADC和LCC中，蛋白表达阴性的占59％，低表达的占67％。在BAC中蛋白表达呈中等或高水平的占80％，但统计分析却显示蛋白表达水平与其它肺癌没有明显区别（P=0.40)。再以脑胶质细胞瘤［1］为例，Ⅰ－Ⅲ级的mRNA表达明显低于Ⅳ级。从脑胶质细胞瘤的资料可以推测恶性程度高的肿瘤EGFR表达多，这与EGFR的过度表达与肿瘤病人的生存期缩短、对化疗不敏感等结论一致；但与Hirsch FR等［3］的结论（分化好的肿瘤EGFR蛋白表达多）相矛盾。其原因还需要进一步的实验研究来阐明。
7 种族与EGFR表达
1996年，Moul JW等［17］提出EGFR表达与种族无关（实验中只有16例美国黑人），由于该实验标本例数太少从而缺乏可信度。到2003年，Wanqing Liu等［18］分析183例高加索人，84例美国黑人，66例亚洲人（26例中国人，10例日本人，20例台湾人，10例东南亚人）的资料显示：CA重复20次，亚洲人占63％，高加索人和美国黑人分别占21％与14％；相反，CA重复16次，高加索人和美国黑人分别占43％与42％，而亚洲人中仅占17％。对于20/20CA基因型，亚洲人占41％，高加索人和美国黑人分别仅占7％与1％；相反，对于16/16CA基因型，高加索人占18％，美国黑人和亚洲人分别占15％，，5％；而在亚洲人中，中国人（16％）CA重复16次的比例明显低于其它亚洲人（25％））。以上数据可以看出CA重复次数与种族有密切关系（Fisher’s Exact test，P值均小于0.005）。根据CA重复次数与mRNA及蛋白表达的关系，可以得出EGFR表达与种族相关。Buerger H等［19］以乳腺癌病人为研究对象，证明日本人CA重复16次的频率比高加索人高，并且肿瘤的EGFR表达较高。对于CA重复16次在不同种族之间的频率，Wanqing Liu［18］等与Buerger H等［19］的实验结果不一致，其原因还需要进一步的实验分析；但都可以得出EGFR表达与种族相关的结论。2004年，Brian Shuch等［20］关于前列腺癌的报道再次证实EGFR表达与种族有关（实验中有142例美国黑人），并且该报道显示：美国黑人比白人的EGFR表达更多(45%美国黑人比18%白人;P＝0.0006)。
8 小结与展望
EGFR的表达是多因素，多步骤综合作用的结果。影响EGFR表达的内在因素包括基因扩增与转录。在内在因素中，基因扩增不能被排除，尽管基因扩增在绝大多数肿瘤包括头颈部鳞癌（约15％），乳腺癌，肺癌中比例很低。由于EGFR表达主要与mRNA的表达有关，可以肯定CA-SSR1多态性在一定程度上影响EGFR的表达［8］。其它因素，比如：饮食、肿瘤易感因子（烟，酒）等都是经内在因素而影响EGFR的表达。由于EGFR表达的复杂性，个体多样性，实验技术的限制等，目前还不能精确分析特定个体及特定肿瘤的EGFR表达。随着对EGFR基因的进一步认识与分子生物学技术的发展，使正确认识EGFR的表达成为可能，从而为EGFR靶向治疗提供坚实的理论基础与精确的治疗方向。
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