去感热注射液指纹图谱进样方式的研究

【摘要】 　　目的 建立去感热注射液挥发性成分指纹图谱的进样方式。方法 采用直接进样、固相微萃取、有机溶剂提取、吹扫捕集和顶空进样等进样方式进行比较。结果 选定顶空进样为指纹图谱研究的进样方式。结论 本方法为去感热注射液的挥发性成分的指纹图谱研究提供了可靠的进样方式。

【关键词】 去感热注射液；气相色谱；指纹图谱

　　ＡＢＳＴＲＡＣＴ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To set up the most suitable sampling injection mode for the fingerprint of the volatile components in Quganre Injection.Ｍｅｔｈｏｄｓ The techniques of direct injection， solidphase microextraction， organic solvbent extraction， purgetrap sampling and headspace sampling were applied， their effects in fingerpring were compared.Ｒｅｓｕｌｔｓ Headspace sampling was chosen for fingerprint study.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Headspace sampling is reliable in studying the fingerprint of volatile components in Quganre Injection.

　　ＫＥＹＷＯＲＤＳ Quganre Injection　　gas chromatography　　fingerprint

　　在70个中药注射液的指纹图谱研究中，柴胡注射液，鱼腥草注射液，去感热注射液［1］，醒脑注射液等多个品种需要建立挥发性成分的指纹图谱测定条件，条件要求所有挥发性色谱成分达到分离，能客观、真实地表达各色谱成分；为了追踪各色谱成分的来源和归属，此条件应同时满足中药材和各生产环节的中间体样品的指纹图谱测定要求，要建立这样的测定条件，无疑是一道技术难关。各研究单位在攻克难关时，一般均从色谱分离和制样(包括进样)技术两方面求得突破。在分离技术上均已获成功，在制备样品，特别是进样方式上，存在各种看法和争议。焦点是所得指纹图谱的信息量。
　　
　　去感热注射液由青蒿、竹叶柴胡、芦竹根和石膏四味中药提取制成，其中青蒿、竹叶柴胡用其水蒸汽蒸馏的挥发性部分；本文主要研究了去感热注射液挥发性成分用固相微萃取、吹扫捕集和顶空直接进样，液液萃取后进样和直接进样等进样方式的条件，并对各进样方式的信息量和重复性进行评估与比较。提出选择顶空进样作为去感热注射液指纹图谱测定的进样方法的依椐。本研究可供其它挥发性成分的指纹图谱进样方法研究作为参。

　　1 仪器与试药
　　
　　美国安捷伦公司Agilent 6890N气相色谱仪，氢火焰离子化检测器（FID）， Agilent 6890N色谱工作站（安捷伦科技有限公司），TEKMAR DOHRMANN 3100 Sample Concentrator吹扫捕集器， MilliQ 超纯水仪（MILLIPORE公司）。去感热注射液由雅安三九药业有限公司及四川大陆蓉东制药有限公司提供。乙醚、正己烷（均为分析纯，成都化学试剂厂），超纯水(电阻率18.2MΩ·cm) 。

　　2 方法与结果

　　2.1 采用气相色谱法。用HP5(5%苯基95%二甲基聚硅氧烷)色谱柱（30m×0.53mm×1.50μm）（Agilent公司）。色谱条件：进样口温度：200℃，氮气总流速：25ml.min-1，分流比：10：1；氮气柱流速：2.0 ml.min-1，柱温：初始50℃保持1分钟，以5℃.min-1升温至160℃保持17分钟即可；FID检测器：温度260℃，氢气流速：35 ml.min-1，空气流速：350 ml.min-1，尾吹流速：30 ml.min-1。

　　2.2 直接进样 取去感热注射液1μl直接注入气相色谱仪进样，考察去感热注射液中主要含有的挥发性成分的种类和量的大致比例。见图1。
　　
　　图1 直接进样色谱图（略）

　　Fig 1 Chromatogram of Sample Injection

　　2.3 固相微萃取 固相微萃取为近年新兴的进样方式，可对样品富集后再行进样，可提高样品的色谱响应。取去感热注射液用固相微萃取法测定，固相微萃取所得图谱中较多组分保留在固相微萃取柱上，不能完整地表达样品的指纹特征。见图2（上图为固相微萃取的色谱图，下图为顶空进样的色谱图）。注：本组色谱图所用色谱柱为HP5(5%苯基95%二甲基聚硅氧烷)色谱柱（30m×0.32mm×0.25μm）。

　　图2 固相微萃取色谱图（略）

　　Fig 2 Chromatogram of solid-phase microextraction

　　2.4 有机溶剂萃取直接进样法 取去感热注射液2ml，用正己烷2ml提取，取正己烷层1μl进样，结果正己烷干扰低沸点成分的检测。见图3。

　　图3 正己烷萃取色谱图（略）

　　Fig 3 Chromatogram of n-hexane extraction
　　
　　取去感热注射液2ml，用乙醚2ml提取，取乙醚层1μl进样，结果乙醚同样干扰低沸点成分的检测，但乙醚对高沸点成分中的苯甲醇有极高的提取效率。见图4。
　　
　　图4 乙醚萃取色谱图（略）

　　Fig 4 Chromatogram of aether extraction
　　
　　顶空进样

　　2.4.1 静态顶空进样 顶空进样为目前对挥发性成分进行测定时使用较多的进样方式。其优点为可减少水作溶剂时水对毛细管柱涂布物的影响，而挥发性成分又可得到测定。
　　
　　取去感热注射液2ml加氯化钠1g置10ml顶空瓶中，摇匀，放置12小时以上后，80℃平衡30min，取顶空气1ml进样。所得色谱图的色谱峰分离良好，各色谱峰的色谱行为稳定，色谱重现性好，依法测定5份，用相似度软件计算其相似度，结果平均相似度为：0.998，RSD=0.23%。见图5。
　　
　　图5 顶空进样色谱图（略）

　　Fig 5 Chromatogram of headspace sampling

　　2.4.2 吹扫捕集 吹扫捕集亦为近年新兴的进样方式，是顶空进样的另一种形式，又称动态顶空。可对样品富集后再行进样，可提高样品的色谱响应并免去有机溶剂的干扰，具有信息量大、客观的优点。取去感热注射液1ml，置10ml量瓶中加超纯水稀释至刻度，摇匀，取1ml注入吹扫捕集器。吹扫捕集条件：样品转移线温度230℃，样品温度40℃，解吸温度250℃。在此条件下去感热注射液出峰信息量很大，且色谱峰强度较高，色谱行为稳定，但因吹扫捕集器不是常用仪器，考虑到指纹图谱工作的推广，最终未采用本进样方式，但该方式可作为去感热注射液指纹图谱研究工作中定性研究的一种手段。见图6。
　　
　　图6 吹扫捕集色谱图（略）

　　Fig 6 Chromatogram of purge and trap sampling
　　
　　以上共选用了五种进样方式对去感热注射液进行研究；五种方式各有特点，直接进样，操作最简单，但取水溶液直接进样信息量不大，且水溶液对毛细管涂布物会有影响；有机溶剂萃取-直接进样法也是常用方法，可有机溶剂会对色谱信息进行干扰，要找到适宜的有机溶剂比较困难；固相微萃取虽为较新的进样方式，但其丢失的信息量太多，不宜于真实的反应指纹图谱的特征；吹扫捕集所得结果信息量多且强，色谱行为稳定，但吹扫捕集仪不是常用仪器，若要配置经费花费较高；顶空直接进样所得色谱信息量适中，色谱行为稳定，重现性好，经费投入不高，为可行的进样方式。

　　3 讨论

　　3.1 进样条件 本研究中、各种进样方式的条件均分别进行优化研究；对于固相萃取，核心是富集与脱附的完整性；液液萃取重 在有机溶剂的选择与破乳；固相微萃取的固定相平衡条件；吹扫捕集以吹扫温度和吹扫时间、脱附温度作为关键参数进行优化；顶空进样则从平衡温度、平衡时间、样品量等多层次、多角度进行研究，选择合理的平衡条件。为了使注射液中挥发性物质从水溶液中尽量析出，加氯化钠使注射液饱和可使溶液中挥发性成分从水中游离出来，在顶空平衡时更容易达到平衡；而氯化钠的饱和过程也是一个动态平衡过程，经试验需放置过夜，方能达到平衡。顶空进样平衡条件的确立试验中还对平衡温度和平衡时间分别进行了考察，考察温度为70℃、80℃、90℃；考察时间分别为10min、20min、30min、40min；经试验在80℃平衡30min后样品色谱行为稳定，无高温分解现象。

　　3.2 关于进样方式的筛选条件 指纹图谱的测定要求是充分表达被测样本的物质信息，即各种组分和它们的存在量。所以在进样条件筛选的过程中首先保证了主组分的检出和各组分的量的比例。

参考文献

　　［１］ Drug Specifications Promulgated by the Ministry of Public Health，P R China.Part 1，Vol.12(卫生部药品标准).WS3-B-2301-97．

　　［2］ 国钧，徐珞珊．常用中药材品种整理和质量研究［Ｍ］．第三册，福州：福建科学技术出版社.1999.1～42.