小鼠HMGN2干扰质粒psilencecmv4.1HMGN2构建及体内干扰效果鉴定

　　　　作者：韩琴 邓璐霞 赵静 吴桂霞 曹玥 范波 李夏 陈善泽 高祥 黄宁

【摘要】 目的：构建小鼠HMGN2干扰质粒psilencecmv4.1HMGN2，以进一步明确HMGN2的生物学作用。方法：将HMGN2shRNA片段退火后与小鼠psilencecmv4.1链接，饲养孕小鼠，尾静脉注射法导入shRNA表达质粒，提取8.5d胚胎RNA，用RTPCR检测胎HMGN2的表达量进行鉴定。结果：测序结果显示psilencecmv4.1HMGN2干扰质粒构建成功，RTPCR结果显示HMGN2在8.5d胎儿表达较高广泛表达，且Psilencercmv4.1HMGN2尾静脉注射后有明显的抑制效果。结论：成功构建对8.5d胎鼠HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer4.1HMGN2干扰质粒，为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。

【关键词】 HMGN2;Psilencerc mv4.1HMGN2

HMGN2是染色体的构组成分，可能与维持DNA分子的构型、基因的活化有关。人类基因组中有多个与HMGN2的cDNA具有相同序列的拷贝，目前认为拷贝数达35-50个之多[1]，也就是说HMGN2的编码基因属于一多基因家族，而这一多基因家族的大多数成员是不表达蛋白质的假基因，属于加工过的假基因(Processed Pseudogene)。这种多基因家族一般是细胞功能调节的关键性基因，常被称为看家基因(Housekeeping Gene)[2，3]。目前通过人鼠基因杂交的方法发现人类HMGN2多基因家族中的功能基因仅有一个，它定位于一号染色体1P36.1[4]。全长3450bp，由六个外显子构成，其基因上游是富含GC(75%)的区域，另外其上游启动子区域包含一个“HTF”岛以及在其他看家基因中常见的调控序列[5，6]。此外，HMGN2基因的编码序列在各物种中具有高度的保守性，例如：人与牛和鸡的同源性分别达96%和92%，这一切说明HMGN2基因具有看家基因的特点，可能在生物的进化和细胞功能中起到重要作用。

　　目前对HMGN2功能的认识尚不完善，众多学者比较一致的观点是HMGN2可能与DNA的复制与转录活性有关[7]。早在上世纪八十年代Swerdlow和Stein等人[8]就提出HMGN2与核小体结合，能稳定核小体核心小体(Core Particle)的空间构象使之更容易被DNaseⅠ消化。一些实验结果表明HMGN2具有消除染色体结构阻碍性的生物活性。尽管对于HMGN2的作用机制研究日益加深，但迄今为止对其的认识仍很有限。本研究旨在通过小鼠HMGN2干扰质粒Psilencecmv4.1HMGN2构建及干扰效果鉴定，进一步明确HMGN2的生物学作用，深入阐明其调节转录的分子机制以及对于其他基因表达的调控作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料及试剂

　　表达质粒Psilencecmv4.1，PEGFPN1质粒购自clontech公司(USA)。RTPCR试剂盒，T4连接酶，胶回收试剂盒(Takara公司);质粒提试剂盒(赛百盛公司);DNA重组所用的各种限制性内切酶(晶美公司);提取及纯化细胞总RNA所用Trizol、逆转录试剂盒(Invitrogen，美国);连接试剂盒(上海生工)。氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(kana)(华北制药厂)，宿主菌Ecoli DH5α由本室保存。BCA蛋白提取试剂盒(南京凯基生物有限公司)，Omega去毒素提取试剂盒，western blot所需缓冲液(成都宝信生物耗材有限公司)，HMGN2以及组蛋白抗体(santa cruze，USA)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 设计HMGN2的干扰序列

　　设计2对长度为19 bp的小RNA干扰片断，其中序列1、2为候选的有效干扰片断，阳性对照以及阴性对照，所有片断均通过BLAST软件验证其正确性。合成的互补DNA序列以备定向克隆入psilencecmv4.1 HMGN2干扰序列1、2如下所示：

　　序列1：正义链：5'GATCCTCTGCGAGGTTGTCTGCTATTCAAGAGATAGCAGACAACCTCGCAGATCA3'

　　反义链：5'AGCTTGATCTGCGAGGTTGTCTGCTATCTCTTGAATAGCAGACAACCTCGCAGAG3'

　　序列2：正义链：5'GATCCAAATGGAGATGCCAAAACATTCAAGAGATGTTTTGGCATCTCCATTTTCA3'

　　反义链：5'AGCTTGAAAATGGAGATGCCAAAACATCTCTTGAATGTTTTGGCATCTCCATTTG3'

　　1.2.2 构建小鼠psilencecmv4.1HMGN2质粒

　　室温下用0.5ml无菌小离心管中建立退火缓冲液反应体系，95℃水浴孵育。离心，温和翻转混匀，制备成50μM双链DNA。取载体Psilencecmv4.1 10μl分别使用BamHI和HidIII双酶切，Takara的胶回收试剂盒回收，取双链产物5μl，加水至体积为10μl，充分混匀，16℃过夜。采用CaCl2法常规制备DH5a感受态宿主菌，转化DH5a感受态宿主菌，涂布于含有Kana的LB培养基平板，37℃培养过夜。选数个菌落接种于3 ml含Amp的LB液体培养基中，固定于37℃摇床上，震荡培养。离心、收集菌体，提取并纯化质粒，PCR鉴定。

　　1.2.3 尾静脉注射法导入SiRNA表达质粒

　　健康5周龄昆明雌性小白鼠。每只腹腔注射PMSG 5U，42-48h后注射相同剂量的HCG，与雄鼠按1∶1的比例合笼。次日早晨检查雌鼠阴栓，见阴栓日中午记为0.5dpc(days post coition，交配后天数)。将妊娠雌鼠随机分组，每组10只，常规饲养待用;提取Psilencercmv4.1HMGN2和Psilencercmv4.1去内毒素质粒，检测浓度与纯度，保存待用。

　　妊娠8.5d的母鼠随机分成3组，分别为Psilencercmv4.1HMGN2组、Psilencercmv4.1组和空白对照组(给予同剂量的生理盐水)。SiRNA表达质粒或同等体积(100-200μl)的生理盐水从尾静脉注入孕鼠体内。Psilencercmv4.1HMGN2组或Psilencercmv4.1组于妊娠5.5d的时期分别给予尾静脉注射Psilencercmv4.1HMGN2或Psilencercmv4.1HMGN2 40μg，于8.5dpc将雌鼠以脱颈处死，迅速分离子宫，取出胚胎，提取胚胎RNA。

　　1.2.4胎鼠HMGN2表达量的测定

　　采用半定量RTPCR和Western blot检测胎鼠EGFP的表达量。

　　2 结果

　　2.1 干扰质粒Psilencecmv4.1HMGN2EGFP测序鉴定

　　经Takara公司测序，序列同设计引物双链序列一直，可进行后续试验(如图1)。

　　图1 干扰质粒psilencecmv4.1HMGN2EGFP测序图

　　图28.5d胚胎组织总RNA电泳

　　2.2 RNA质量鉴定

　　8.5d胚胎的提取总RNA，1%琼脂糖电泳鉴定显示条带清晰。紫外分光光度计测定光密度值，OD260/OD280比值均高于1.9。确定各样本总RNA未降解，可进行下一步实验(如图2)。

　　2.3 RTPCR 以及Western blot 检测HMGN2的表达

　　RTPCR电泳结果显示HMGN2在8.5d胎儿呈现较高广泛表达，且Psilencercmv4.1HMGN2尾静脉注射后有明显的抑制效果，抑制效果达到了原有表达量的70%(如图3)。

　　图3 RTPCR对HMGN2表达情况的测定

　　3 讨论

　　在较早以前的染色体异常的研究资料就表明：1P远端区域的染色体异常与一些恶性疾病及细胞的异常生长有关，而HMGN2基因定位于1P36.1，1P36这一区域的染色体异常与多种肿瘤的发生有关[9]。有一些实验数据显示HMGN2可能与一些恶性疾病(如一些肿瘤、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、混合性结缔组织病、青少年风湿性关节炎等)的发生有关[10]：SLE病人的自身抗体能与HMGN2反应，这一发现提示HMGN2在这类自身免疫疾病的发生发展中可能是一重要靶位。

　　目前已有一些研究资料表明：HMGN2在胚胎发育及器官发生中起重要作用。Mohamed 和Bustin 等人[11]将HMGN2的反义寡核苷酸注入大鼠单细胞受精卵中，可以检测到HMGN2蛋白在双细胞及四细胞阶段的缺失，以及相应的单细胞分裂成双细胞、双细胞分裂成四细胞胚胎的延迟。另外人工合成的HMGN2的DNA结合区多肽注入双细胞胚胎后，可以延迟其进入四细胞阶段。Lehtonen 等人[12]应用Northern Blotting的分析方法发现：HMGN2的mRNA在大鼠胚胎形成中高表达，而在成熟大鼠的各种器官中表达水平较低;在组织学水平上，HMGN2在各种分化组织中表达较高，而在成熟组织中表达较低，这意味着HMGN2的表达与细胞分化密切相关，HMGN2可以作为组织或细胞在器官发生中正在分化的标志。

　　近年来陆续有小型哺乳动物尾静脉高压注射干扰质粒达到理想干扰效果的报道。已有一些研究表明，转染效率与注射体积和注射速度无关，而与注射DNA的剂量有关。并且有研究报道进一步指出注射5μg质粒DNA是比较合适的，超过25μg质粒DNA会造成小鼠中毒，但在不引起中毒的剂量允许范围内加大质粒DNA的注射剂量对提高转染效率是有帮助的。

　　本研究通过构建小鼠HMGN2 shRNA表达质粒shRNA1和shRNA2，在胚胎早期成功的干扰HMGN2表达有助于我们进一步的研究HMGN2在胚胎发育以及基因调节的重要作用。

参考文献

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　　11Mohamed OA，Bustin M，Clarke HJ.Highmobility group proteins 14 and 17 maintain the timing of early embryonic development in the mouse[J]. Dev Biol， 2001， 229(1): 237-249.

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