百合知母汤及其组方药味的高效液相色谱电喷雾质谱研究

　　　　 作者：秦昆明 方前波 蔡皓 陈志鹏 杨光明 蔡宝昌

【摘要】 建立了百合知母汤的高效液相色谱电喷雾质谱（HPLCESIMS）分析方法，对百合知母汤及其组方药味中的主要成分进行了鉴定。根据正离子模式和负离子模式下的分子离子峰获得化合物分子量信息，通过与文献数据或部分对照品对照，确定化合物的可能结构。实验表明，百合知母汤中各主要化学成分在正离子模式中响应较好。在相同的条件下，通过对百合知母汤及其组方药味进行比较分析，归属并鉴定了百合知母汤中的38个成分，包括3个黄酮，4个酚酸糖苷和31个皂苷类成分。本实验为鉴别百合知母汤中的化学成分提供了一种简便、快速的方法。

【关键词】 高效液相色谱电喷雾质谱，百合知母汤，方剂

　　1 引言
　　
　　方剂中含有大量的化学成分，这些成分是方剂发挥临床药效的物质基础。只有阐明方剂的药效物质基础，才能进一步挖掘方剂的配伍规律和作用机制。因此，方剂的药效物质基础研究是方剂现代研究的重点基础性工作。近年来，液相色谱/质谱（LCMS）联用技术[1～4]被广泛应用于方剂的成分分析和鉴定中，为方剂复杂成分的快速归属和鉴定提供了重要方法。
　　
　　百合知母汤始载于汉代张仲景所著的《金匮要略》，由百合和知母两味药组成。研究表明，百合知母汤对抑郁症具有较好的疗效。本实验室前期药效学研究表明，百合知母汤对绝经综合症大鼠的相关药效学指标具有明显的调节作用[5]。为了探索百合知母汤的药效物质基础，本研究采用高效液相色谱电喷雾质谱（HPLCESIMS）联用方法对百合知母汤及其组方药味中的化学成分进行分析，对其中的主要化学成分进行鉴定并归属了其药材来源。此外，本实验还总结了百合知母汤中不同类成分的质谱规律。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器、试剂与材料
　　
　　岛津LCMS2020高效液相色谱质谱联用仪（日本岛津公司），包括SPDM20A二极管阵列检测器，质谱为LCMS2020单极四级杆，电喷雾离子源（ESI）。乙腈和甲醇（色谱纯，美国Tedia 公司）; 甲酸（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司），其余试剂均为分析纯。百合(Lilium lancifolium Thunb.)购自江苏宜兴，知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.) 购自河北易县，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定，均符合《中华人民共和国药典》(2005版)规定。新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、王百合苷A、王百合苷B、知母皂苷AⅢ、知母皂苷B、知母皂苷BⅣ、知母皂苷I 对照品均为本实验室自制，经波谱分析后确证结构，纯度大于98%。

　　2.2 色谱质谱条件
　　
　　色谱条件：ShimPack VPODS色谱柱（150 mm ×2.0 mm， 5 μm， 日本岛津公司）； 流动相： A为0.05%甲酸水溶液， B为乙腈； 梯度洗脱： 0 min， 8% B； 30 min， 15% B； 40 min， 22% B； 60 min， 28% B； 75 min， 35%B； 90 min， 55% B； 95 min， 80% B； 100 min， 8% B。 流速： 0.2 mL/min； 柱温30 ℃； 二极管阵列检测器（PDA）记录200～400 nm紫外光谱， 检测波长为315 nm。
　　
　　质谱条件：电喷雾电离（ESI）； 探针温度350 ℃； 曲形脱溶剂装置（CDL）温度280 ℃； 加热模块温度320 ℃； 探针电压 4.5 kV； 检测器电压 1.5 kV； CDL电压 50 V； Qarray 电压：DC 50 V，RF 120 V； 干燥气流速3.5 L/min； 雾化气流速1.5 L/min。正、负离子模式同时检测，全扫描质量范围m/z 100～1300。

　　2.3 标准品溶液配制
　　
　　准确称量新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、王百合苷A和王百合苷B各5.0 mg，分别置于5 mL容量瓶中，加入适量50%甲醇溶解并定容，得到浓度为1 g/L标准品储备液；准确称量知母皂苷AⅢ、知母皂苷B、知母皂苷BⅣ和知母皂苷I各5.0 mg，分别置于10 mL容量瓶中，同法配制0.5 g/L标准品储备液。进样前将标准品储备液用50%甲醇稀释10倍。进样体积：3 μL。

　　2.4 百合知母汤及其组方药味供试品溶液制备
　　
　　称取百合药材粉末（０．４５～０．７０ mm粒径）1.5 g， 知母药材粉末（0.４５～0.７０ mm粒径)0.5 g，加入50 mL蒸馏水，浸泡30 min，置电炉上煎煮1 h，过滤，再向药渣中加入50 mL蒸馏水，同法再煎煮1 h，过滤，合并两次煎出液，浓缩、定容至50 mL，即得百合知母汤样品溶液。取百合知母汤样品溶液20 mL于烧杯中，缓缓加入无水乙醇80 mL，进行沉淀、过滤，用20 mL蒸馏水溶解沉淀。同法再用乙醇沉淀一次，合并两次滤液，水浴蒸干，用50%甲醇溶解并定容至5 mL，即得百合知母汤供试品溶液（折合原药材0.4 g/mL）。按照处方量分别称取百合，知母单味药材，同法分别制成百合和知母供试品溶液。所有供试液均过0.45 μm微孔滤膜，取3 μL进样。

　　3 结果与讨论

　　3.1 分析条件的优化
　　
　　百合知母汤中酚酸糖苷类成分和黄酮类成分都有一定的酸性，采用乙腈水为流动相时，色谱峰拖尾较严重，加入甲酸可以使这些化合物达到较好的分离。黄酮类和酚酸糖苷类成分在PDA上响应较强，而皂苷类成分在MS上响应较好，综合考虑3类成分的响应，优化了液相分析条件，并选择315 nm为检测波长，结果见图1a。本实验还对质谱的射频电压（RF）、雾化气流速、毛细管电压等参数进行了优化，确定了质谱分析条件。在正离子模式和负离子模式下，百合知母汤中各类化合物均有一定的响应，但正离子模式比负离子模式的响应值更高，结果见图1b 和图1c。由图1可见，黄酮类和酚酸糖苷类成分响应值较低，而皂苷类成分有很高的响应值，出峰也较多。

　　图1 百合知母汤的液相色谱图（a）和正离子模式（b）与负离子模式（c）下的质谱总离子流图（略）

　　Fig.1 Liquid chromatogram(a) and mass spectrometric total ion chromatogram(b) in positive ion mode(c) in nedative ion mode of Baihe Zhimu Tang

　　3.2 百合知母汤中化学成分的鉴定

　　3.2.1 黄酮类成分的鉴定 百合知母汤中黄酮类成分主要有3种：新芒果苷、芒果苷和异芒果苷，均来自知母，分子量分别为584， 422和422。通过与对照品的保留时间和质谱数据比较，确认了这3种成分在TIC图中的位置，编号分别为1，2和3（见图1）。在正离子模式中，3个化合物都出现[M+H]+离子和[M+Na]+离子， 在芒果苷的质谱图中，还出现了[2M+Na]+离子；在负离子模式中，3个化合物均出现[M－H]－离子，其中芒果苷质谱图中还出现[2M－H]－离子，结果见图2。

　　3.2.2 酚酸糖苷类成分的鉴定 酚酸糖苷类是百合中的特征性成分，在PDA上中响应较好，在MS上中响应较弱（见图1）。通过对比质谱数据（见表1）发现，化合物4和5，6和7的分子量相同，可能是异构体。利用对照品进一步对照，指认了其中2个成分，同时

参考文献

[６，７]鉴定了另外2个成分的结构。

　　表1 百合知母汤酚酸糖苷类成分的HPLCESIMS数据及成分鉴定（略）

　　Table 1 HPLCESIMS data and identification of phenolic glucosides in Baihe Zhimu Tang

　　3.2.3 皂苷类成分的鉴定 百合及知母中均含有多种皂苷类成分。为了更准确的鉴定百合知母汤中的皂苷类成分，对百合和知母单味药进行了分析，将单味药的TIC图谱（见图3）与复方的TIC图谱作了比较，对皂苷类成分进行归属。结合文献［８～1１］和部分化学对照品，鉴定了31个皂苷类成分，其中方剂中的知母皂苷AⅢ、知母皂苷B、知母皂苷BⅣ和知母皂苷I的结构是利用与标准品对照确认的，表2中给出了部分代表性皂苷类成分的质谱数据(详表见http://www.analchem.cn/table/090636.pdf)。化合物28和29的分子量均为886，文献[1２]报道，这两个化合物为百合中的皂苷类成分， 但结构有待进一步确证。

　　图2 百合知母汤中黄酮类成分的质谱图（正负离子同时检测模式）（略）

　　Fig.2 MS spectra of flavonoids in Baihe Zhimu Tang (positive ion and negative ion detection mode)

　　1. 新芒果苷（Neomangiferin）; 2. 芒果苷（Mangiferin）; 3. 异芒果苷（Isomangiferin）。 a. 正离子模式（Positive ion mode）; b. 负离子模式（Negative ion mode）。

　　图3 百合(a)与知母(b)的正离子模式质谱总离子流图（略）

　　Fig.3 Mass spectrometric total ion chromatograms in positive ion mode for Lilium lancifolium Thunb.(a) and Anemarrhena asphodeloides Bge(b)

　　表2 百合知母汤中部分代表性皂苷类成分的HPLCESIMS数据及成分鉴定(简表)（略）

　　Table 2 HPLCESIMS data and identification of some representative saponins in Baihe Zhimu Tang（Brief）

　　▲ 来源于百合（Ｄerived from Lilium lancifolium Thunb.）；★ 来源于知母（Ｄerived from Anemarrhena asphodeloides Bge.）。
　　
　　3.3 质谱规律分析
　　
　　由质谱数据可以发现百合知母汤中3类成分的质谱规律：在负离子模式下，皂苷类成分都出现了[M+Cl]－峰，而且在[M+35]－峰附近都有氯的同位素峰出现，进一步确证了皂苷类加氯峰的存在，这与文献[1４]吻合。大部分皂苷类还有[M－H]－峰， 酚酸糖苷类成分仅有[M－H]－峰，而黄酮类成分出现[M－H]－峰或[2M－H]－峰；在正离子模式下，皂苷类成分都有[M+Na]＋峰，个别皂苷有[M+H]＋峰，酚酸糖苷类成分具有[M+Na]＋或[M+K]＋峰，而黄酮类成分都具有[M+H]＋和[M+Na]＋峰，其中芒果苷还有[2M+Na]＋峰。这些质谱规律对于这3类成分的质谱鉴定具有参考价值。

　　致谢 感谢南京海昌中药饮片有限公司在HPLCDADMS分析仪器方面提供的帮助。

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