作者：陈美兰，华永丽，黄璐琦，林淑芳，杨光
【摘要】 目的 分析龙脑樟有性繁殖后代变异情况。方法 以龙脑樟有性繁殖后代的3个月和12个月实生苗为材料，对其叶片的挥发油进行GC和GC-MS分析，以主要的9个成分的相对百分含量为指标对样本进行聚类，并对主要成分进行相关性分析。结果 栽培3个月的幼苗产生2种化学型，即黄樟油素型和丁香酚甲醚型;栽培12个月的幼苗成分较栽培3个月的幼苗成分复杂，形成了龙脑型，同时形成了樟脑型、桉油素型、异橙花叔醇型。结论 龙脑樟有性繁殖后代会发生化学变异，其中只有60%保持了母本特性。
【关键词】 龙脑樟;有性繁殖后代;挥发油
Abstract：Objective To analyze the variations in the chemical components of leaf oil extracting from reproductive progenies of Cinnamomum camphora chvar. Borneol. Methods The leaf oils of three month or twelve month old seedlings was analyzed by GC and GC-MS. According to nines main components of the essential oil， a dendrogram of all samples was made and the correlation of main components was analyzed. Result Analysis on leaf oil of three month old seedlings showed two chemotypes， safrole and methyleugenol. Analysis on leaf oil of twelve month old seedlings showed four chemotypes， borneol， camphor， cineole and Isonelidol. Conclusion Chemical components of leaf oil from reproductive progenies of Cinnamomum camphora chvar. Borneol is different， and only 60% propagated progenies keep the same features as their parents of Cinnamomum camphora chvar. Borneol.
Key words：Cinnamomum camphora chvar. Borneol;propagated progenies;volatile oil
药用植物樟Cinnamomum camphora (L.) Pvesl为樟科樟属植物，是一种开发天然精油价值很高的经济植物。同一个种内具有几个不同的化学型，是樟属植物各个种的共性和普遍现象，也是樟属植物生物多样性的独特表现形式。樟树有9个化学类型，即樟脑型、龙脑型、柠檬醛型、1.8-桉叶油型、芳樟醇型、异橙花叔醇型、黄樟素、Sepuiterpene、sesquiterpenealcohol等[1]。其中龙脑型——龙脑樟(Cinnamomum camphora chvar. Borneol)是20世纪80年代发现并发展起来的新的樟树化学类型，其枝叶精油富含天然冰片(天然右旋龙脑)，是提取天然冰片的理想原料[2]。樟树传统的繁殖是采用种子育苗法，但种子繁殖最大的缺陷是后代个体变异性大，母株的诸多优良性状，如高龙脑含量性能在后代中很难稳定延续[3]。本试验研究不同生长时期龙脑樟实生苗叶片精油化学成分变化的情况，旨在为今后从植物生理学的角度研究龙脑樟以及其他化学型形成的机理提供基础，并指导今后龙脑樟的生产和应用。
1 材料
龙脑樟种子来源于江西省吉安市林科所天然冰片厂龙脑樟种植基地同一棵母树，经中国中医科学院中药研究所黄璐琦研究员鉴定为樟科樟属龙脑樟植物的种子。随机从10棵龙脑樟母树的种子中各取10粒种子进行发芽，将幼苗进行栽培，分别于3个月和12个月测定叶片中的挥发油。
2 方法
2.1 仪器
Trace GC气相色谱仪，FID检测器，hp-5毛细管柱，NIST谱图库检索。
2.2 色谱条件
载气为氮气，柱温为50 ℃，进样口温度230 ℃，检测器温度240 ℃;升温程序：50 ℃以3 ℃/min升温速率升至220 ℃，保持10 min。
2.3 质谱条件
TRACE MS;离子源：(EI+)质量范围：35～300 amu;扫描周期：5 s/dec。
2.4 样品提取方法
分别取幼苗叶片约1 g，剪碎混合均匀后浸泡1 h，用水蒸气蒸馏法提取叶片中的挥发油。所得挥发油进行气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析，采用峰面积归一化法确定其主要组份的相对百分含量，GC-MS确定化合物的化学成分。
3 结果与分析
3.1 栽培3个月幼苗叶油的分析结果
GC和GC-MS分析表明，幼苗叶片精油中含量较高的成分主要有黄樟油素和丁香酚甲醚，但精油中龙脑的含量很低，甚至没有。栽培3个月的幼苗叶片精油发生了种内化学变异，主要存在2种化学型，一种以黄樟油素为主成分，另一种以丁香酚甲醚为主成分。见图1、图2。
注：A.黄樟油素;B.丁香酚甲醚
图1 黄樟油素化学型GC图谱 图2 丁香酚甲醚化学型GC图谱
3.2 栽培12个月幼苗叶油的分析结果
GC和GC-MS分析表明，植株叶片精油含量较栽培3个月的植株高，且成分较复杂，含量相对较高的化学成分是龙脑、樟脑、1，8-按叶油素、黄樟油素、萜品醇、水芹烯、α-蒎烯、异橙花叔醇、乙酰龙脑等，共占叶油化学成分总含量的80% 左右。叶片精油也发生了种内化学变异。
3.2.1 叶油化学成分聚类分析 为分析有性繁殖后代植株的变异情况，笔者以9个主要成分的面积归一法百分含量为指标，对龙脑樟有性繁殖后代实生苗进行聚类。具体分析方式如下：用SPSS 软件中的Hierarchical cluster analysis(分层聚类)，分类方法采用Between-groups linkage(组间连接)，距离公式为Squared Euclidean distance，对上述样品进行聚类分析，结果见图3。
图3 龙脑樟有性繁殖后代叶油化学成分聚类
由图3可以看出，对比每个观测量的化学成分含量与聚类的结果，发现35份观测量聚为4类时，类间距离比较大，因此，根据龙脑樟树有性繁殖后代叶片精油主要化学成分的聚类结果将龙脑樟树有性繁殖后代分为4类化学型，这与我们根据GC图(见图4)主峰成分进行分类的结果一致。
3.2.2 叶油各化学型分布分析 为分析变异规律，对变异的各个类型进行分析统计(见表1)。由表1可以看出，龙脑樟有性繁殖后代，只有60%能保持母本特性，主成分为龙脑，其他40%后代变异为桉油素型、樟脑型和异橙花叔醇型，而没有后代变异为芳樟醇型。
3.2.3 主要成分相关性分析 使用SPSS统计软件对龙脑樟有性繁殖后代精油中的主要9个成分的相关性进行分析，发现桉油素分别与水芹烯和萜品醇呈极显著正相关(相关系数分别为0.990和0.978);龙脑分别与萜品醇、水芹烯、桉油素、樟脑、异橙花叔醇和异丁酸橙花酯呈显著负相关，相关系数为-0.531、-0.527、-0.397、-0.530、-0.358和-0.352，异橙花叔醇与异丁酸异橙花叔醇呈显著正相关，分析结果见表2。表2 主要化学成分之间相关性分析结果(r)
4 讨论
4.1 叶油主要成分生源关系的分析
由表2看出，桉油素与萜品醇有极其显著的相关性，相关系数达到0.9以上，我们从单萜的代谢途径中发现萜品醇是桉叶油合成的前体物质。龙脑与其他三类的樟脑、桉油素、异橙花叔醇有显著的负相关，龙脑、樟脑、桉油素为单萜化合物，它们三者存在共同代谢途径，在生物合成途径过程中竞争同一反应底物，即一种底物形成多种化合物，一种次生代谢产物形成多，另一种或几种则形成少或没有;而龙脑与异橙花叔醇也都为萜类化合物，也具有共同的前体物质，存在竞争关系，次生代谢物龙脑产生的多则异橙花叔醇则产生的少或没有。异橙花叔醇与异丁酸橙花叔醇有极其显著的相关性，相关系数达到0.9以上，揭示异丁酸橙花叔酯可能是异橙花叔醇合成的前体物质。根据文献报道[4-5]的萜类生源学途径、单萜代谢途径及其各个成分之间的相关性推导出4种化学型的生源学途径(见图5)。
注：
图5 各化学型主成分生源学关系
4.2 龙脑樟化学型形成与植物的生长发育阶段有关
栽培3个月的幼苗虽然也产生了种内化学变异，但是主成分是黄樟素或丁香酚甲醚，龙脑的含量很少甚至没有，这与报道的樟植物幼根中的主成分相似[1]。然而，栽培了12个月后植株叶片精油才分化出龙脑型。因此，这可能表明龙脑樟化学型形成与植物的生长发育阶段有关。植物在不同的生长发育阶段具有其特殊的新陈代谢机制，而这种特殊的新陈代谢机制影响了植物的次生代谢产物的生成，因而影响了植物体内各种次生代谢产物的有无或者之间的比例，因此还应该从植物生理角度研究不同化学型形成的机理。程氏等[6]在研究细毛樟时也发现其有性繁殖后代1年以下植株叶片精油主成分不发生分化，而1年以上才发生分化。杨氏等[7]在研究细毛樟香叶醇合酶基因时也发现香叶醇的合成与储存器官是植物叶片的油细胞。
4.3 龙脑樟有性繁殖后代变异的原因
从同一株龙脑樟母树上采集的种子在外部形态上没有明显的特征性差异，且繁殖栽培1年获得的实生苗从外部形态上看植株没有显著的区别，但叶片的挥发油主成分发生了变化，子代只有60%的实生苗能够保留原有的化学型，其余子代则发生了变异，20%的植株变异成油樟，11.43%的植株变异成脑樟，8.57%的植株变异为异樟，但是没有变异为芳樟醇型的植株。文献报道，同属植物细毛樟(C.tenuipilum)叶油中富含芳樟醇、香叶醇、金合欢醇等化学型的有性后代中只有56%～68%的植株可保持母本的特性，其他的植株分化为别的化学型[8]，细毛芳樟(Cinnamomum tenuipilum Kosterm)有性后代经香韵初步鉴别的208株中，含芳樟醇的有142株，占总株数的68.27%，不含芳樟醇的有66株，31.73%[9]。这表明樟属植物普遍存在有性后代叶油主成分发生变异的现象。
植物的产量、品质、化学成分等大多是数量形状，是由多基因所控制，所以变异的产生可能源于多基因位点控制的效应，这种多基因位点控制的酶不同，促使不同化学成分的积累。龙脑樟有性繁殖后代发生化学变异可能源于个体发育的差异，而个体发育差异受多方面因素的影响，如母性遗传效应、营养条件不同或发育阶段、年龄不同等[10]，我们在试验中控制了营养条件和发育阶段使其一致，而自然授粉种子繁殖的樟树因周围生长的不同化学型而使基因重组，产生了不同的化学变异，因此变异情况可能与周围生长的化学型密切相关。文献报道某种化学型比较多则是在子代就比较容易变异成该种化学型[4]，我们在调查过程中也发现本实验采用的龙脑樟母本植物周围存在油樟、异樟、脑樟，但没有发现芳樟醇型的存在，在吉安种植区内芳樟醇型的植株也比较少，且只开花不结果。
另外，在相同的外部环境生长的龙脑樟有性繁殖后代发生了变异，这也可能是因为植物内环境如内生菌起一定的作用，有文献报道发现植物的内生菌在特定的环境和生理条件下，能将植物体内和外源的化学物质转化产生另一类化合物[11-12]。本试验室也对樟树5个化学型的内生菌进行研究，发现在不同化学型中存在特异内生真菌，但其是否影响不同化学型化学成分的生成积累，还有待于进一步研究。龙脑樟后代繁殖之所以发生变异，其原因可能是由多基因控制的遗传效应和环境效应的作用。
参考文献
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