作者：樊秦，李应东，赵文君，景明
【摘要】 目的 研究超滤法分离纯化当归多糖组分的工艺。方法 采用截留不同分子量的膜对当归多糖提取液进行超滤，并对操作参数进行正交设计，以当归多糖为检测指标优选膜分离工艺条件。结果 当归多糖分别用相对分子量为200、100、50、20 kD的超滤膜进行分离。超滤前多糖含量30.47%，超滤后200 kD以下的多糖含量最高，为65.42%。试验确定超滤操作条件为：加1倍量的水，操作温度35 ℃，操作压力0.3 MPa。结论 该工艺简单可行，所得到的当归多糖纯度较高。
【关键词】 当归多糖；超滤法；纯化；正交试验
Abstract：Objective To isolate and purify polysaccharide from Angelica sinensis by ultrafiltration technology. Methods Extract of polysaccharide of Angelica sinensis was ultrafiltrated with different aperture membrane， the separation parameters on membrane separation efficiency of polysaccharide of Angelica sinensis were optimized by and orthogonal test. Results Polysaccharide of Angelica sinensis was separated with 200， 100， 50， 20 kD membrane. The contents of polysaccharide was 30.47% before ultrafiltration. The main component of Angelica sinensis polysaccharide was the fraction with 200 kD (65.42%). The optimum condition of ultrafiltration was obtained as follow：one times of extract volume， 35 ℃， 0.3 MPa. Conclusion The technology was simple and available， and the content of Angelica sinensis polysaccharide was higher.
Key words：Angelica sinensis polysaccharide；ultrafiltration；purification；orthogonal test
当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根，其主要成分为阿魏酸、挥发油、多糖等。近年来研究发现，当归多糖在补血、去除自由基、提高免疫力、对抗肿瘤、抗辐射损伤等方面也有显著作用。但目前当归多糖多以粗多糖的形式利用，质量难以控制，药效重复性差。为此，本试验采用微滤结合不同截留相对分子质量的超滤装置对当归多糖进行了分级纯化研究，确定试验操作条件，考察各级相对分子质量范围内的多糖分布情况及所得制品中当归多糖的含量，为当归多糖及超滤技术在医药领域和保健品行业中的开发应用提供理论依据。
1 仪器与试药
膜分离机(型号：FlOWMEM 0015)；UV-2401PC紫外可见分光光度计(日本岛津)；BS110S电子分析天平；BUCHI B-290喷雾干燥仪(瑞士)。当归来自甘肃GAP生产基地；苯酚、浓硫
酸、葡萄糖、95%乙醇等均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 当归多糖含量测定条件
对多糖最大吸光度、显色条件、苯酚用量、浓硫酸用量、显色时间和显色温度进行选择，确定最佳测定条件为：5%苯酚用量为1.0 mL，浓硫酸用量为6.0 mL，放置于40 ℃的水浴中10 min后，冰浴5 min，检测波长490 nm。
2.2 标准曲线的绘制
精密吸取标准葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，分别加水至2.0 mL，各精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸6 mL，摇匀，置于40 ℃水浴10 min，取出，置冰水浴中5 min，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅤA]，立即在490 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：A＝61.29C＋0.001 5，r＝0.999 1，葡萄糖浓度在0.003 2～0.015 9 mg/mL间与吸光度呈良好的线形关系。
2.3 当归多糖含量测定
取经超滤的各组分约0.5 g分别用蒸馏水溶解定容至25 mL，精密吸取2 mL，加95%乙醇10 mL离心，取沉淀置50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，精密吸取样品2 mL，按“2.2”项下方法测定。
2.4 当归多糖超滤提取工艺
根据正交试验确定制备工艺流程为：水提(8倍量水，回流提取3次，每次1.5 h，合并滤液)→离心→微滤→超滤→截留液→除蛋白→醇析→喷雾干燥产品。该工艺路线能有效去除提取液中的微尘、粗纤维、胶质等大分子物质， 经超滤装置进行超滤，可得截留浓缩液。醇析中乙醇浓度对多糖含量有重要影响，根据正交试验确定用70%乙醇进行醇沉，醇析效果最佳。
2.5 当归多糖超滤工艺条件的优选
2.5.1 不同孔径膜分离效果比较
膜的孔径或截留相对分子质量的选择虽然主要是根据被分离物的相对分子质量大小来确定，但分子的实际尺寸与其构型、聚集状态有关，而且还与溶液的浓度有关。由于提取得到的料液粘度较大，高分子胶体物质较多，膜污染现象严重，因此，采用0.1 μm的膜先微滤，除去大分子杂质，再分别选用截留相对分子质量为200、100、50、20 kD的4种膜，对有效成分截留率及产品多糖含量进行比较。综合考虑，选用截留相对分子质量200 kD的膜所得到产品中当归多糖含量高。见表1。表1 不同超滤膜的截留结果（略）
2.5.2 膜分离操作参数的选择
采用正交试验法，以当归多糖含量为指标，就加水量(A)、操作压力(B)、料液温度(C)对分离效果进行考察。正交设计因素水平见表2，正交试验结果及直观分析见表3，方差分析见表4。表2 因素与水平（略）表3 膜分离当归多糖的正交试验结果和直观分析（略）表4 以当归多糖含量为指标的方差分析（略）注：F0.05(2，2)＝19.00
由直观分析可见，影响因素的主次关系为：A＞B＞C。方差分析表明，A和B因素对当归多糖含量有显著影响，C因素对当归多糖含量没有显著影响。因此，选择膜分离最佳的操作参数为：加水倍数为1倍，压力0.3 MPa，料液温度35 ℃。
称取药材按A1B1C1进行验证试验，结果与正交试验结果吻合，说明工艺可行。
3 讨论
综合截留率、得率两方面，选用截留相对分子质量200 kD 的膜较合适，截留物7.81 g，当归多糖含量为65.42%。为了提高膜的工作效率，保持有效成分的稳定性。膜分离最佳的操作参数为：加水倍数为1倍，压力0.3 MPa，料液温度35 ℃。
使用超滤纯化无需有机溶剂，也不需要加热，能根据所需的不同分子量范围去除杂质，得到纯度较高的多糖。当归多糖经超滤后，与只用醇沉工艺的粗多糖比较，总提取物由约14.80 g下降到7.81 g，多糖纯度由30.47%提高到65.42%。
本试验结果表明，对当归水提液进行超滤较单纯醇沉法能更有效地保留多糖成分，去除杂质，提高制剂的稳定性。并且通过选择适宜的超滤膜及膜分离参数，可以达到比单用醇沉法更好的纯化效果，而且超滤法操作简单，适宜规模化生产。