作者：明海霞，黄世佐，刘喜平，李海龙，金戈，李杨
【摘要】 目的 复制寒饮射肺证动物模型，观察单叶细辛对该模型大鼠肺通气功能相关指标的影响。方法 将30只Wistar大鼠随机分为单叶细辛组(单叶细辛水提液灌胃1 mL/kg)、辽细辛组(辽细辛水提液灌胃1 mL/kg)、盐水组(0.9%NaCl溶液灌胃1 mL/kg)。各组给药均为每日1次，连续6 d。在给药第6日灌胃后用7 ℃冷生理盐水做整肺灌洗，灌洗量2.5 mL/kg，保留30 s后抽出，5 min后重复灌洗1次，连续5次，造成寒饮射肺模型，合并5次灌洗液备用。比较肺灌洗前后各组血栓素B2(TXB2)、内皮素(ET)、灌洗液磷脂与蛋白质含量的变化。结果 整肺灌洗后盐水组TXB2、ET、蛋白质含量均明显升高，而磷脂含量较低。单叶细辛组、辽细辛组TXB2、ET、蛋白质含量较低而磷脂含量较高，与盐水组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而单叶细辛组和辽细辛组比较差异无统计学意义。结论 单叶细辛可抑制寒饮射肺证大鼠TXB2、ET的产生，减少灌洗液中蛋白质含量，有效改善肺通气。
【关键词】 单叶细辛；辽细辛；血栓素B2 ；内皮素；磷脂；动物模型
Abstract：Objective To study the effects of single leaf Asarum on pulmonary ventilation in experimental rats with syndrome of cold fluid shooting lung. Methods Wistar rats were randomly pided into three groups including singe leaf Asarum group [fed with water extracts of singe leaf Asarum 1 mL/(kg·d)]， singe leaf Asarumi Miq group [fed with water extracts of singe leaf Asarumi Miq 1 mL/(kg·d)] and normal saline group [fed with 0.9% normal saline 1 mL/(kg·d)]. After fed continually for 6 days， whole lung of rats were washed with normal saline [7 ℃， 2.5 mL/(kg·d)] and then were perfused for 30 seconds. This treatment was repeated 5 times every 5 minutes to make the model of cold fluid shooting lung. The fluid of perfusion was collected and detected. The changes of TXB2， ET， protein and phospholipids of the fluid were measured before and after lavage. Results TXB2， ET and protein in the perfusing fluid ascended obviously， while phospholipids were low in normal saline group. TXB2 and ET in singe leaf Asarum group and single leaf Asarumi Miq group were less than that in normal saline group (P＜0.05)， but no statistical significance was found between single leaf Asarum group and single leaf Asarumi Miq group. Conclusions Single leaf Asarum can reduce TXB2， ET and protein in perfusing fluid enhance pulmonary ventilation in experimental rats with syndrome of cold fluid shooting lung.
Key words：single leaf Asarum；single leaf Asarumi Miq；thromboxane B2；endothelin；phospholipid；animal model
《中华人民共和国药典》规定细辛正品为马兜铃科植物北细辛、汉城细辛或华细辛的干燥全草[1]，其中华细辛与汉城细辛临床又统称为辽细辛。但由于以上品种生长缓慢、货源紧缺，临床广泛以马兜铃科植物单叶细辛的带根全草作为代用品使用，习称“甘肃细辛”或“草细辛”。笔者根据中医理论复制了寒饮射肺证动物模型，就单叶细辛对该动物模型肺通气功能相关指标的影响进行了研究，现报道如下。
1 实验材料
1.1 仪器
SN-682放射免疫计数器，南京桑力电子设备厂生产；BECKMAN DU-65型自动分光光度计，SHIMAp公司生产；可调式微量移液器，上海求精生化试剂仪器有限公司生产；XYJ80-2电动离心机：金坛市恒丰仪器厂；XK96-A型快速混匀器，上海手术器械厂生产；CS930型薄层扫描仪，SHIMAp公司生产。
1.2 药物与试剂
单叶细辛与辽细辛由甘肃中医学院附属医院中药房提供，经本院中药教研室鉴定，药化教研室用水提法模拟临床用药剂型制备成浓度为1 g原药材/mL的溶液备用。乌拉坦(25%氨基甲酸乙酯)，上海化学试剂供应站提供，批号0402032。血清内皮素(ET)、血栓素(TXB2)放射免疫分析药盒均由北京科美东雅生物技术有限公司提供。
1.3 动物
7～8周龄Wistar大鼠，体重(200±20)g，雌雄兼用，兰州生物制品研究所提供。
2 实验方法
2.1 分组及给药
Wistar大鼠30只，随机分为3组：单叶细辛组，以单叶细辛水提液1 mL/kg灌胃；辽细辛组，以辽细辛水提取液1 mL/kg灌胃；盐水组，以0.9%NaCl溶液1 mL/kg灌胃。各组给药均为每日1次，连续给药6 d。
2.2 整肺灌洗复制寒饮射肺模型
各组动物于第6日灌药后以25%氨基甲酸乙脂(4 mL/kg)腹腔注射麻醉，背位固定，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉备用，用20号套管针穿刺置管并结扎固定，备采血以监测血气。钝性分离暴露气管，于甲状软骨下方做纵行切口，插入“Y”型气管插管，固定后，吸净血液，左侧管经张力换能器与BioLap410生物信号监测系统呼吸通道相连，30 Hz滤波，时间常数0.1 s，速度1 mm/s，待呼吸平稳后读取相关指标；右侧管插入软塑料内套管，固定后按2.5 mL/kg灌注7 ℃冷生理盐水入肺内，保留30 s后抽出，5 min后重复灌洗1次，连续5次，合并5次灌洗液备用。按上述方法，寒饮射肺动物模型复制成功，按要求取标本并进行检测。
2.3 血栓素、内皮素的检测
TXB2、ET采用放射免疫分析法，操作严格按说明书进行。所需血样均由颈总动脉采集。
2.4 磷脂与蛋白质的检测
分别取各组5次灌洗液的混合液各2管，低速离心去除细胞杂物后，一管以氯仿-甲醇(2∶1)萃取，定磷法，用自动分光光度计测定总磷酯含量；薄层层析法展开，钼酸法染色，用薄层扫描仪分析磷脂成分。另一管用自动分光光度计比色测定蛋白含量。观察并比较各组混合灌洗液中磷脂与蛋白质含量的变化。
3 统计学方法
应用SPSS10.0统计软件包处理，各组实验数据以x±s表示，组间差异采用LSD检验。
4 结果
4.1 一般情况
盐水组大鼠出现闭眼，毛发竖直，精神萎靡，呈蜷缩状，懒动，头藏于腹下，呼吸急促，爪趾、口唇黏膜紫绀，活动减少，捕捉时不逃窜或挣扎不强烈。单叶细辛组、辽细辛组上述症状明显改善，一般状况良好，呼吸较平稳，精神状况和活动表现与平常无异。毛发顺滑，反应敏感，捕捉时逃窜并强烈挣扎。无死亡大鼠。
4.2 单叶细辛对寒饮射肺证模型大鼠血栓素与内皮素的影响
(见表1)表1 单叶细辛对寒饮射肺证模型大鼠TXB2与ET的影响(略)注：与盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01(下同)
4.3 单叶细辛对寒饮射肺证模型大鼠肺灌洗液中磷脂与蛋白质含量的影响
(见表2)表2 单叶细辛对寒饮射肺证模型大鼠肺灌洗液中磷脂与蛋白质含量的影响(略)
5 讨论
寒饮射肺证属中医肺系常见病证，常见咳喘气急、痰多稀白以及舌苔水滑、脉滑等。细辛可温化寒饮，为治疗寒饮射肺证常用药物。由于寒冷因素可导致各种炎性介质和细胞因子的释放，促使气管平滑肌收缩、气道反应性增高、肺通气阻力增大。近年来发现，呼吸道上皮细胞和血管内皮细胞产生的ET是引起平滑肌收缩、痉挛和气道重建的重要介质，也是现阶段所知的人体内最强活性的长效缩血管多肽，能强烈而持久地收缩血管，对动静脉均有很大的致挛作用，能直接收缩肺血管，使肺血流量减少，同时刺激血管平滑肌细胞，加重肺损害，其收缩强度是白三烯的100倍和乙酰胆碱的1 000倍。ET除可以直接作用于呼吸道平滑肌，也可以促进介质的释放间接作用于呼吸道，还能作用于呼吸道的神经导致呼吸道收缩[2]。这些因素不仅加剧平滑肌的收缩程度，还使小气道平滑肌自身的收缩反应性异常增高，最终导致气道高反应性和通气功能低下[3]。
TXA2可使血小板内环磷酸腺苷减少，游离Ca2+增多，以致血小板脱粒释放内源性ADP，因此，它是很强的血小板诱聚剂和血管收缩剂。TXB2是其代谢产物，TXB2与ET通过不同途径加重肺脏损害。所以，实验结果中盐水组TXB2、ET等缩血管物质的明显升高说明血管发生了强烈收缩，这不但使肺血流量明显减少，还可能引起微血栓形成，从而加重肺损伤。盐水组TXB2、ET在灌洗前后变化非常明显，两者均明显升高。但单叶细辛组、辽细辛组各指标在灌洗前后变化相对较小，提示单叶细辛可能通过抑制TXA2、ET合成或分泌的某一环节从而改善有效肺泡通气量，稳定肺泡血-气屏障，减少肺血管渗出。
肺泡表面张力是形成肺通气阻力的主要原因之一[4]。肺表面活性物质(PS)可降低肺泡表面张力，Ⅱ型上皮细胞是PS合成和储存的场所。PS是由磷脂、中性脂肪和特异蛋白组成的复合物，其中磷脂占80%～85%，以二棕榈卵磷脂(DPPC)及磷脂酰甘油(PG)为主，8%～10%是一些表面活性蛋白质(surfactant protein，SP)，特异性蛋白质是PS中重要的免疫物质。SP包括亲水性SP-A、SP-D和疏水性的SP-B、SP-C，以SP-A的含量最高。二棕榈卵磷脂是降低肺泡表面张力的主要成分，但必须通过SP才能起作用[5]。
众所周知，血中蛋白漏入肺泡是引起肺损伤的原因之一，因而人们猜测在疾病时PS相关蛋白也可漏入血管内，故血清SP-A水平可能是一个判断肺功能疾病时所致肺毛细支气管膜损伤的有用指标。有人认为，肺损伤时血浆蛋白渗入肺泡，有抑制PS功能的作用[6]。
本研究采用7 ℃冷生理盐水做整肺灌洗的方法复制了寒饮射肺的动物模型。结果表明，盐水组蛋白质含量高，而磷脂含量则较低；单叶细辛组、辽细辛组灌洗液中蛋白质含量较低，而磷脂含量较高，且单叶细辛与辽细辛组间无明显差异。其中占总磷脂绝大部分比例的卵磷脂和磷脂酰甘油是PS的主要成分，表明单叶细辛具有良好的保护Ⅱ型肺泡上皮细胞合成、分泌PS的作用。灌洗液中的蛋白质成分主要来源于小气道与肺泡表面毛细血管血液，单叶细辛组蛋白质含量明显少于盐水组，表明单叶细辛尚具有保护肺毛细血管内皮细胞，降低对寒冷、化学物质和肺水肿的血管不良反应，减少蛋白质渗出的作用。
综上所述，单叶细辛对寒饮射肺模型大鼠肺通气功能的改善有可能通过减少炎性介质的释放、降低气道反应性和舒张支气管平滑肌、降低气道阻力等途径来实现。初步表明单叶细辛在治疗寒饮射肺，气逆喘咳方面具有优势。至于单叶细辛在治疗过程中对其他炎性介质和细胞因子的影响，有待今后进一步研究。
参考文献
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