作者：周青，熊伟，张国民，方圆，肖红玉，龚秀英
【摘要】 目的 观察三草安前汤对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNF RⅡ)基因和蛋白表达的影响，阐明中药复方治疗慢性非细菌性前列腺炎的炎症因子蛋白靶点。方法 将72只健康雄性Wistar大鼠随机分为6组，每组12只，除正常组外，其余5组应用大鼠前列腺蛋白提纯液辅以免疫佐剂制备实验性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型，正常组、模型组予生理盐水，西药组予消炎痛，三草安前汤大、中、小剂量组分别予不同剂量的三草安前汤连续灌胃。30 d后处死，采用免疫组织化学、荧光定量RT-PCR等方法检测炎症因子 mRNA及蛋白表达。结果 三草安前汤可显著降低慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠炎症因子IL-1β、IL-6的mRNA及蛋白表达水平(P＜0.01)，且大、中剂量组作用优于小剂量组(P＜0.05)，大、中剂量组与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；三草安前汤各剂量组TNF RⅡ表达降低，未随剂量增加出现明显变化(P＞0.05)。结论 三草安前汤对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠异常的免疫功能有调节作用，降低炎症因子表达是其治疗慢性前列腺炎的重要机理。
【关键词】 三草安前汤；慢性非细菌性前列腺炎；炎症因子；动物模型
Abstract： Objective To observe the effects of Sancaoanqian decoction on expression of cytokine IL-1β， IL-6 and TNF RⅡ in experimental autoimmune prostatitis rats， and explore the target protein of cytokine of Chinese herbal compound in treating chronic nonbacterial prostatitis. Methods Seventy-two male Wistar rats were pided randomly into six groups and 12 rats in each group. All groups were made experimental autoimmune prostatitis rat model by injecting SC purified prostate protein with FCA except normal group. The normal and model group were given saline， western medicine group was given indomethacin， large， medium and small doses decoction groups were treated with large， medium and small doses of Sancaoanqian decoction. All rats were sacrificed after 30 days. The mRNA and protein expression of cytokines were tested by methods of immunohistochemistry and fluorescent quantitation RT-PCR. Results Sancaoanqian decoction could reduce the mRNA and protein expression of IL-1β， IL-6 in experimental autoimmune prostatitis rats. There were no significant difference between large and medium doses decoction group， but had a better activity than small dose. The expression of TNF RⅡ were reduced in all doses groups and no difference among three doses of Sancaoanqian decoction. Conclusion Sancaoanqian decoction can regulate the immune function in chronic prostatitis rat model. Down-regulation of cytokines maybe one of important mechanisms in treating chronic prostatitis.
Key words：Sancaoanqian decoction；chronic autoimmune prostatitis；cytokine；animal model
慢性非细菌性前列腺炎(CAP)是男科临床常见的难治性疾病之一，炎症因子在CAP的发病过程中与炎症的过程、转归相关。前期临床观察显示，三草安前汤治疗湿热挟瘀型CAP取得满意的临床疗效[1]。为进一步探讨其作用机制，笔者从基因、蛋白水平考察了三草安前汤对CAP模型大鼠炎症因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNF RⅡ)基因表达的影响。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性Wistar大鼠77只，3月龄，体重200～300 g，湖南中医药大学实验动物中心提供。
1.2 主要试剂
免疫组化相关试剂：兔抗大鼠IL-1β单克隆抗体，兔抗大鼠IL-6单克隆抗体(Eptomics公司，美国)；兔抗大鼠TNF Receptor Type Ⅱ单克隆抗体(Prosci公司，美国)；SABC免疫组化试剂盒，DAB显色试剂(武汉博士德)。实时定量荧光RT-PCR相关酶类及试剂：细胞总RNA提取试剂Trizol(Gibco公司，美国)，焦碳酸二乙酯DEPC(Promega公司，美国)；Olig(dT)15， dNTP混合物(上海Sangon)；M-MuLV、RNA酶抑制剂(Promega公司，美国)；SYBR Green Ⅰ荧光染料(罗氏公司，瑞士)。
1.3 主要仪器
DU640核酸及蛋白分析仪(Beckman公司，美国)；721B型分光光度计(上海第三仪器厂)；7300实时荧光定量PCR仪 (ABI，美国)；高速低温离心机(Beckman公司，美国)；TY-80S脱色摇床(江苏华峰仪器有限公司)；台式离心机(Beckman公司，美国)。
2 实验方法
2.1 分组
77只雄性Wistar大鼠，其中5只用于前列腺蛋白提纯液的制备，其余72只随机分6组，分别为正常对照组、模型组、西药组及三草安前汤大、中、小剂量组(以下简称“SCAQ大、中、小剂量组”)，每组12只。
2.2 大鼠前列腺蛋白提纯液的制备
参照文献[2]方法。取实验大鼠5只，无菌条件下剥取前列腺组织，生理盐水洗净，加入含0.5% TritonX-100的生理盐水溶液，冰浴匀浆，10 000 r/min离心30 min。吸上清，比浊法测定蛋白浓度。临用时用0.01 mol/L pH 7.4 PBS调节蛋白浓度至15 mg/mL。
2.3 模型制备
参照文献[2]方法。大鼠乙醚麻醉，腹腔注射百白破疫苗0.5 mL，多点皮下注射大鼠前列腺蛋白提纯液和FCA(1∶1混悬液)1 mL，正常对照组皮下注射生理盐水，30 d重复注射1次。第60日时每组处死2只，取前列腺病理检查，验证造模是否成功。
2.4 药物制备及给药
三草安前汤由金钱草、益母草、白花蛇舌草、红藤、虎杖、丹参、王不留行等药物组成(湖南中医药大学第一附属医院提供)。药物经高压浓缩煎药机煎煮后过滤浓缩，根据人-大鼠体表面积换算系数确定大、中、小剂量组，分别为4.45、2.23、0.89 g/mL原药材量，按1 mL/100 g体重剂量灌胃。西药组给药消炎痛(山西云鹏制药有限公司，批号H14020771)，剂量参照说明书，临用时将药捣碎，生理盐水溶解并稀释成0.9 mg/mL，按1 mL/100 g体重剂量灌胃。造模60 d后各组开始给药，模型组及正常对照组用生理盐水灌胃。30 d时处死大鼠。
2.5 样本取材
末次给药后24 h处死大鼠，剥离前列腺并称重，1/3组织置DEPC水中漂洗3次，迅速入液氮保存待提取总RNA，其余2/3组织入甲醛固定，石蜡包埋切片，病理切片HE染色，免疫组织化学染色。
2.6 免疫组化检测炎症因子表达
根据SABC试剂盒操作说明书进行。
2.7 前列腺组织总RNA的提取及cDNA的制备
根据Trizol RNA提取试剂盒说明书操作。
2.8 引物
采用实时荧光定量RT-PCR的方法，IL-1β、IL-6、TNF RⅡ、18S rRNA PCR引物根据相关基因的大鼠cDNA序列进行设计。引物及探针均由上海生工生物工程公司合成。引物设计采用Primer 5.0软件设计。
2.9 实时荧光定量RT-PCR方法检测前列腺炎炎症因子的基因表达
取反转录的cDNA 2 μL为模板进行PCR反应检测炎症因子基因表达。反应体系：2×SYBR Green PCR minister 20 μL，上、下游引物各1 μL(0.25 μmol/L)，去离子水16 μL。充分混匀后加入cDNA模板2 μL。PCR反应条件：①95 ℃ 10 min；②95 ℃变性15 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，40循环；③85 ℃检测荧光。溶解曲线分析，95 ℃ 1 min，65 ℃ 1 min，以0.1 ℃/s的速度升高温度至95 ℃，连续检测荧光。扩增结束后分析溶解曲线，在溶解曲线上具有(85±0.8)℃ Tm峰判断为PCR扩增的单一性。同时设无模板对照、无RT对照及阳性对照。目的基因mRNA定量：取一定量的cDNA模板，分别2、5、8、10倍稀释，依次进行实时PCR扩增，建立标准曲线，以β- actin mRNA的模板量为参照，计算目的基因的相对模板数。
3 统计学方法
实验数据用x±s表示，采用方差分析，组间比较用q检验。全部数据经SPSS10.0统计软件包处理，P＜0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
造模前每组大鼠12只，造模及灌胃过程中模型组死亡1只，SCAQ小剂量组死亡1只，60 d时为评估造模情况每组处死2只，最后剩余正常组10只，模型组9只，西药对照组10只， SCAQ小剂量组9只， SCAQ中剂量组10只，SCAQ大剂量组10只。所有动物于给药后30 d时处死。
4.2 各组大鼠前列腺组织白细胞介素-1β、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子受体Ⅱ蛋白表达
IL-1β的棕色的阳性反应主要在前列腺腺泡上皮细胞的胞浆或间质，细胞核不染色，部分组织还可见阳性反应的条索状结构；IL-6在正常前列腺组织中有少量表达，主要表达细胞为腺腔内上皮细胞；TNF RⅡ表达主要存在于腺体上皮细胞胞膜上。结果见表1。表1 三草安前汤对CAP模型大鼠前列腺组织炎症因子蛋白表达水平的影响(略)注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01(下同)
4.3 各组大鼠前列腺组织白细胞介素-1β、白细胞介素-6及肿瘤坏死因子受体ⅡmRNA表达(见表2)
运用实时荧光定量PCR方法分析了三草安前汤治疗后CAP大鼠IL-1β、IL-6、TNF RⅡmRNA在前列腺组织中的表达。将样品进行系统稀释扩增后做标准曲线来确定各基因和β-actin mRNA的相对表达量，在不同稀释度的样品中扩增了目的基因的cDNA，在PCR反应中，低浓度的cDNA导致荧光信号增长较慢，每个反应都使用β-actin作为内对照。SCAQ各剂量组以及西药组治疗后IL-1β、IL-6、TNF RⅡ mRNA在模型大鼠前列腺组织中的表达情况见表2。表2 三草安前汤对CAP模型大鼠前列腺组织炎症因子mRNA表达水平的影响(略)
5 讨论
有研究表明，CAP患者前列腺分泌物或精液中可出现某些炎症因子水平变化[3-4]。本研究结果显示，CAP模型大鼠存在炎症因子IL-1β、IL-6、可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNF RⅡ)表达增高的现象，提示炎症因子的参与是CAP发病的重要机制之一。在表达阳性的炎症因子中，IL-1β、IL-6可促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放[5-6]；sTNF RⅡ作为炎症因子受体参与调节细胞因子释放以及促炎因子、抗炎因子的平衡[7]；尤其TNF-α、IL-1β被认为是慢性前列腺炎症持续存在的标志[8]。本研究中仅检测到IL-1β增高而TNF-α不增高，根据检测结果中IL-6、sTNF RⅡ表达增强的结果，推测可能原因一是TNF-α多参与急性炎症反应过程，或在炎症程度较重的情况下表达增高，而长期的炎症状态下TNF-α并不增高；二是TNF-α可促进IL-6的分泌，虽然二者可以协同加剧炎症反应，但IL-6持续表达增高又可下调TNF-α的合成；三是炎症因子的动态平衡作用，可能与sTNF RⅡ表达增强可抑制TNF-α表达增加有关。
CAP属中医“精浊”范畴。中医学认为其基本病机是湿热瘀阻，治宜清热利湿、活血化瘀。三草安前汤方中金钱草味甘、淡，气微寒，归肾、膀胱经，功能清热利湿，通淋消肿，为君药。益母草味苦、辛，气微寒，归肝、心、膀胱经，有活血兼利水湿之功，为臣药。王不留行味苦气平，归肝、胃经，善通利血脉，有活血通络之功；白花蛇舌草味微苦，气寒，清热解毒、利湿散结；红藤味苦、气平，清热解毒、活血止痛；虎杖味苦、气寒，清热解毒、活血祛瘀；丹参味苦、气微寒，有活血化瘀作用，共为佐使。全方合用，共奏清热利湿、活血化瘀之功。本研究结果显示，三草安前汤可显著降低炎症因子IL-1β、IL-6的mRNA及蛋白表达水平；TNF RⅡmRNA出现下调，但sTNF RⅡ蛋白水平也同时出现下调，sTNF RⅡ来源于细胞膜TNF RⅡ，并可通过竞争TNF RⅡ发挥保护性作用，两者均降低表明三草安前汤并不能直接参与TNF RⅡ或s TNF RⅡ的调控，而是治疗后TNF-α水平降低，通过机体TNF-α、TNF R、sTNFR体系的反馈作用间接导致TNF RⅡ表达的降低。由此可见，参与免疫调节是三草安前汤治疗CAP的机理之一。
参考文献
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