【摘要】 目的 观察补益肝肾、活血化瘀方二至丸、失笑散及其合方对胆汁淤积性肝纤维化大鼠肝组织尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)的影响。方法 采用胆管结扎复制胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型。造模大鼠于术后1周随机分为模型组、优思弗组、二至丸组、失笑散组及合方组；各药物干预组分别给予相应药物灌胃，模型组和假手术组给予等量生理盐水灌胃，至4周末处死全部动物取材。观察各组大鼠一般情况、肝功能(ALT、AST、ALP、TBil)、肝组织病理、uPA蛋白表达(Western blot法)。结果 与假手术组比较，模型组大鼠ALT、AST、ALP、TBil、纤维化程度均显著升高。与模型组比较，3个复方均能降低大鼠血清ALP、ALT、AST水平(P＜0.01)，失笑散及合方能降低TBil(P＜0.01)，合方改善ALP、ALT优于两个单方。3个复方均能不同程度地减轻模型大鼠肝纤维化程度(P＜0.01)，合方优于两个单方。优思弗能降低ALT、AST水平，但对肝脏纤维化无明显改善作用。与模型组比较，3个复方组uPA蛋白表达显著增加(P＜0.01)，其中合方组最高，失笑散组次之，再次为二至丸组，三者之间比较差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。结论 二至丸、失笑散及其合方均可不同程度地干预胆汁淤积性肝纤维化形成，其机制可能与调控uPA蛋白表达有关。
【关键词】 胆汁淤积性肝纤维化；二至丸；失笑散；尿激酶型纤溶酶原激活剂；Western印迹；大鼠
Abstract：Objective To study the effects of the Chinese herbal compound (Erzhiwan， Shixiaosan and combined formula) on cholestasis-induced liver fibrosis rat’s uPA. Methods Bile duct ligation method was used to make the model of cholestasis-induced liver fibrosis. One week after the operation， the rats were randomly pided into five group (model group， UDCA group， Erzhiwan group， Shixiaosan group and hefang group). Each medicine intervention group was given corresponding medicine by intragastric administration. Sham and model group were given sodium chloride with equal dosage. At the end of 4th week， all rats were sacrificed and sampled. General state of health， hepatic function (ALT， AST， ALP， TBil) and pathological histology of hepatic tissue were recorded and measured. Results Compared with the sham group， the level of ALT， AST， ALP， TBil and the degree of liver fibrosis in model group were advanced significantly. Compared with model group， three Chinese herbal compound decreased serum level of ALP， ALT and AST (P＜0.01). Shixiaosan and hefang decreased serum level of TBil (P＜0.01). Hefang was better than simple recipe on ALP and ALT. Three herbal compound released liver fibrosis to some extent (P＜0.01)， and hefang was better than simple recipe. UDCA decreased serum level of ALT and AST， but had no effect on liver fibrosis. Compared with model group， uPA expression significantly increased in three Chinese herbal groups (P＜0.01)， and hefang group was the highest， Shixiaosan group was the middle， Erzhiwan group was the lowest. Conclusion Chinese herbal compound (Erzhiwan， Shixiaosan and hefang) with the function of tonifying liver and kidney， promoting blood circulation and removing blood stasis can inhibit the cholestasis-induced liver fibrosis. The mechanism was probably related to regulating uPA expression.
Key words：cholestasis-induced liver fibrosis；Erzhiwan；Shixiaosan；uPA；western blot；rat
尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)属于丝氨酸蛋白酶家族，可通过uPA-纤溶酶-基质金属蛋白酶(MMP)级联反应途径调控纤溶酶和MMP活性，影响细胞外基质(ECM)合成与降解，与肝纤维化关系密切。目前，肝纤维化中医基本病机属血瘀、正虚两方面的理论已基本达成共识。迄今，有关抗肝纤维化复方研究的立法组方主要集中活血化瘀和扶正(益气养血或补益肝肾)两大类的结合，活血化瘀结合扶正固本为中医药抗肝纤维化的基本治法。本研究旨在观察补益肝肾和活血化瘀的经典名方二至丸和失笑散及其合方对大鼠胆汁淤积性肝纤维化形成及其uPA蛋白的调控作用。
1 实验材料
1.1 动物
SD雄性大鼠70只，SPF级，体重(260±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2003-0003。饲养于上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心，自由饮食。
1.2 试剂与仪器
HE、Masson染液(上海虹桥乐翔医用试剂有限公司)；uPA抗体试剂盒(Santa Cruz Biotechnology，Inc.)；DEPC(Sigma)；UV-2102C分光光度计(尤尼克公司)；OLYMPUS-ix71显微镜(日本OLYMPUS公司)；低温离心机为(eppendorf公司)；凝胶成像系统(上海四星生物技术有限公司)。
1.3 药物
二至丸由墨旱莲、女贞子各9 g组成；失笑散由五灵脂、蒲黄各6 g组成；合方由墨旱莲、女贞子各9 g，五灵脂、蒲黄各6 g组成。按公式计算给药。大鼠剂量＝人剂量×35(人转换因子)/6(大鼠转换因子)计算出人、鼠等效剂量，二至丸为1.75 g/(kg·d)，失笑散为1.17 g/(kg·d)，合方为2.92 g/(kg·d)。按传统工艺制备成水煎剂，分别减压浓缩至1.75、1.17、2.92 g/mL备用。优思弗(熊去氧胆酸，Dr.Falk Pahrma GmbH产品，注册证号：h30050181，购自上海中医药大学龙华医院)，同样方法计算出人、鼠等效剂量58.3 mg/(kg·d)。所有药物制备、质控由上海中医药大学附属龙华医院制剂中心完成。
2 实验方法
2.1 模型制备
参照文献[1]采用胆管结扎复制胆汁淤积性肝纤维化模型。术前禁食不禁水12 h，盐酸氯胺酮100 mg/kg肌肉注射麻醉，常规腹部皮肤消毒，沿腹正中线切开皮肤，暴露胆总管，于远近端结扎胆总管，中间离断，关腹；假手术组仅开腹暴露并游离胆总管不结扎，关腹。
2.2 分组及给药
SD大鼠70只，假手术组10只，其余60只造模。造模1周后，随机分为模型组(12只)，优思弗、二至丸、失笑散及合方组各10只。各治疗组分别给予相应药物灌胃，每日1次，共计3周；假手术组与模型组以同体积生理盐水灌胃。4周末以盐酸氯胺酮腹腔注射麻醉(2 mL/kg)，腹主动脉采血，处死全部实验动物，分离血清，-80 ℃保存备用。摘取肝脏称重后，于肝右叶切取1.0 cm×1.0 cm大小肝组织2块，4%中性甲醛溶液固定。
2.3 检测指标
2.3.1 一般情况
包括精神状态、活动情况、皮毛光泽度、食量、大小便情况等。
2.3.2 肝脏形态 包括肝脏的重量、外形、色泽、质地。
2.3.3 生化指标测定
谷丙转氨酶(ALT)、谷丙转氨酸(AST)、总胆红素(Tbil)、碱性磷酸酶(ALP)按试剂盒说明书方法测定。
2.3.4 病理学检测
HE染色、胶原纤维染色(Masson)、肝纤维化程度分级标准：汇管区纤维组织无增生为“-”；增生后面积占肝小叶1/3以下为“+”；占肝小叶1/3～2/3为“++”；占肝小叶2/3以上为“+++”。每个“+”记1分，每个标本记总分。积分越高，表明肝脏纤维化程度及病理损害越重。
2.3.5 Western印迹法检测肝组织尿激酶型纤溶酶原激活剂蛋白表达
抗原蛋白提取后采用紫外分光光度计进行蛋白质定量。取总蛋白50 μg，加等量SDS凝胶加样缓冲液，100 ℃变性3 min，100 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳后，采用半干式电转移仪(Bio-Rad公司)，参照厂家提供程序进行转膜。转移结束后，室温下用含50 g/L脱脂奶粉的PBS封闭2 h，封闭结束后加入第一抗体工作液(购自Santa Cruz公司，工作液浓度1∶1 000)，室温下振荡1 h，PBS洗15 min×3次，再加入1∶5 000稀释的二抗(HRP-GAMG购自Bio-Rad公司)，室温下孵育1 h，PBS洗10 min×3，除去未结合的第二抗体。放射自显影，曝光5 min，用密度扫描仪进行密度扫描，测得其灰度值，与相应的β-actin灰度之比表示其蛋白含量。
3 统计学方法
应用SPSS12.0软件进行分析，各组计量资料以x±s表示，计量资料采用方差分析，等级资料采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况变化
假手术组大鼠毛发有光泽，体重增加，体态活泼，食量及二便正常。造模2～3 d后大鼠出现小便发黄，术后7 d，出现尾部黄染、耳黄、毛发黄染等黄疸表现。造模过程中，大鼠死亡5只，大鼠在1 周内死亡3只，为结扎线脱落形成胆汁性腹水致死；2～3 周无死亡，第4 周始大鼠死亡7只，其中模型组4只，优思弗、二至丸和合方组各1只。与假手术组比较，其中模型组体重、肝湿重、肝体重比差异有统计学意义(P＜0.01)；与模型组比较，合方组肝湿重、肝体重比差异有统计学意义(P＜0.01)，二至丸组体重显著升高(P＜0.05)，优思弗组大鼠体重、肝湿重和肝体重比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
4.2 肝脏形态变化
假手术组肝脏表面光滑，呈红褐色，质地软；模型组大鼠肝脏体积增大，表面黄染，质地较硬；3个中药组大鼠肝脏体积较模型组小，表面较模型组光滑；优思弗组肝脏肉眼观察与模型组无明显区别。
4.3 中药复方对模型大鼠肝组织病理的影响
HE染色显示：假手术组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，呈放射状，肝窦正常，胞核结构清晰。模型组大鼠肝脏内小胆管大量增生，以汇管区为中心放射状向肝实质内延伸，增殖的胆管呈花环样，胆管上皮细胞周围有肌成纤维细胞的聚集和细胞外基质的沉积；肝细胞与增生的胆小管相比明显减少，剩余肝细胞的形态结构尚正常。与模型组比较，3个中药组小胆管增生较模型组明显减少，剩余肝细胞量较多；合方组较2个中药单方组病理改变轻；优思弗组胆管增生无明显减少；模型及药物组的炎症及坏死均不明显。肝组织纤维化程度计分评定结果见表1。表1 中药复方对模型大鼠纤维化程度的影响(略)注：与模型组、优思弗组比较，△△P＜0.01；与合方组比较，#P＜0.05，
##P＜0.01
4.4 对模型大鼠肝功能的影响
(见表2)表2 中药复方对模型大鼠肝功能的影响（略)注：与模 型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与优思弗组比较，△△P＜0.01
4.5 中药复方对模型大鼠肝组织uPA蛋白表达的影响
Western blot检测显示：假手术组大鼠肝组织uPA表达极低，模型组uPA表达显著高于假手术组(P＜0.01)，与模型组比较，失笑散组、二至丸组及合方组uPA表达显著增强(P＜0.01)，3个中药复方组之间比较，合方组最高，失笑散组次之，再次为二至丸组，三者之间比较差异有统计学意义(P＜0.05， P＜0.01)。见图1。
5 讨论
肝纤维化是大多数慢性肝病所共有的病理过程，也是各种慢性肝病向肝硬化过度的中间环节，其特征是以胶原为主的过度沉积。因此，促进ECM各成分降解是抗肝纤维化治疗的重要方法。目前研究表明，肝星状细胞(HSC)对ECM调节的重要途径之一就是通过uPA和纤溶酶原激活剂抑制物(PAI)的差异表达，在上游调控纤溶酶和MMP家族的活性，以维持ECM合成与降解之间的平衡[2]。uPA可激活纤溶酶原转变为纤溶酶，纤溶酶不但能直接降解ECM，纤溶酶又是MMPs活化所必需的，现在认为MMPs是最重要的一类降解ECM的蛋白酶类，MMPs直接以酶原的形式分泌到细胞外，只有被活化后才能降解基质蛋白，这是控制ECM的重要调节机制[3-4]。纤溶酶激活部分间质胶原酶和基质分解素原。活化的基质分解素可导致间质胶原酶的完全活化和超活化。活化的MMPs可以切割一种或数种ECM成分，抑制胶原沉积。目前，大多数学者认为uPA及其抑制剂在纤维化的不同阶段起着不同作用。在早期，uPA可能随HSC活化表达上调，活性增加，激活窦周间隙纤溶酶及MMPs，后两者降解肝脏组织中正常的ECM，由于缺乏正常的纤维组织的支撑和营养作用，肝细胞功能受到损害。随着肝纤维化程度加重，活化的HSC分泌PAI-1增加，过多表达的PAI-1通过与uPA结合，降低uPA活性并抑制其纤溶激活作用，进而导致纤溶酶和MMP系统活性下调，ECM沉积明显增加[5-6]。在uPA、纤溶酶及MMP构成的级联激活途径中，uPA活性的改变会直接影响肝纤维化进程。因此，通过调节uPA表达很有可能成为抗纤维化治疗的有效方法。
本研究结果表明，与模型组比较，优思弗虽然可以降低血清AST、ALT水平(P＜0.05)，但对病理组织学无改善，可能与其不能有效地抑制胆管上皮细胞增生有关，与文献报道一致[7]。失笑散和合方能够显著降低胆管结扎所致的TBil、ALP、AST、ALT异常增高，二至丸能降低ALP、AST、ALT活性，但对TBil无改善。在改善TBil方面，合方和失笑散之间无差异；合方在改善ALP、ALT方面优于2个单方；对AST的疗效，合方优于二至丸，与失笑散无差异，但有下降趋势；2个单方在降低ALP、AST、ALT上均无差异。病理结果显示，模型组大鼠胆管大量增生，大量的细胞外基质沉积在增殖的胆管上皮细胞周围，以汇管区为中心向肝实质内延伸，肝窦内只有少量的细胞外基质沉积。3个中药复方均能改善胆管阻塞所致的病理改变，胆管增生明显减轻，在改善纤维化方面，合方效果好于2个单方；3个复方均能上调uPA蛋白含量，失笑散强于补益肝肾的二至丸；合方强于2个单方，这与病理和生化结果一致。随着纤维化的发展， uPA蛋白含量显著提高，至3周时达到峰值，其后显著下降。这提示不同治则中药复方改善纤维化可能是通过提高uPA蛋白含量，进而上调其活性，促进ECM降解，从而延缓肝纤维化进程，同时也提示，对胆汁淤积性肝纤维化的治疗应当综合治疗。至于不同治则的中药复方对胆管上皮细胞的作用机制及其抗纤维化途径尚待进一步研究。
参考文献
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