【摘要】 ：目的 建立以高效液相色谱法测定抗瘤丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的方法。方法 色谱柱为Kromasil C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，使用梯度洗脱系统，流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液；流速为1.0 mL/min；检测波长为203 nm；进样量为10 μL；柱温为30 ℃。结果 三七皂苷R1的线性范围为82.8～621 μg(r＝0.999 9)，平均回收率为100.057%(RSD＝0.399 6%)；人参皂苷Rg1的线性范围为109.8～823.5 μg(r＝0.999 6)，平均回收率为99.248%(RSD＝1.004 6%)；人参皂苷Rb1的线性范围为112.6～844.5 μg(r＝0.999 9)，平均回收率为99.812%(RSD＝1.474 4%)。结论 本方法操作简便、准确，重复性好，可用于抗瘤丸中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1的含量测定。
【关键词】 抗瘤丸 三七皂苷R1 人参皂苷Rg1 人参皂苷Rb1 高效液相色谱法 含量测定
Abstract：Objective To set up a HPLC method for the determination of the contents of notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1 and Rb1 in Kangliu pills. Methods It was performed on Kromasil C18 (4.6 mm×150 mm， 5 μm)， and the mobile phase was acetonitrile-0.05% phosphoric acid with gradient elution system. The flow rate was 1.0 mL/min， the detective wavelength was 203 nm， injection volume was 10 μL and the column temperature was 30 ℃. Results The liner range of notoginsenoside R1 was 82.8～621 μg (r＝0.999 9) and the average recovery was 100.057% (RSD＝0.399 6%). The liner range of ginsenoside Rg1 was 109.8～823.5 μg (r＝0.999 6) and the average recovery was 99.248% (RSD＝1.004 6%). The liner range of ginsenoside Rb1 was 112.6～844.5 μg (r＝0.999 9) and the average recovery was 99.812% (RSD＝1.474 4%). Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， and suitable for the content determination of notoginsenoside R1， ginsenoside Rg1 and Rb1 in Kangliu pills.
Key words：Kangliu pills；notoginsenoside R1；ginsenoside Rg1；ginsenoside Rb1；HPLC；determination
抗瘤丸是由三七、何首乌、琥珀等组成的中药复方制剂，其功效为扶正培本、清热解毒、活血化瘀等；用于脑胶质瘤、脑垂体瘤及其它肿瘤的治疗。抗瘤丸质量控制有性状、鉴别、检验等项目，但仍未建立含量测定方法。三七为本方中的君药，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1为三七的主要有效成分。为了有效地控制该制剂质量，本试验建立了应用高效液相色谱(HPLC)法，测定抗瘤丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的方法。
1 仪器与试药
Agillent1200型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、DAD检测器、自动脱气机、标准自动进样器、柱温箱、化学工作站(美国Agillent公司)；L-200SM型电子分析天平(日本Shimadzu公司)；KQ-250D型超声波清洗器(昆山市超声波仪器厂)。
抗瘤丸(首都医科大学宣武医院自制，批号20060830、20061031、20061226、20070228)；三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品(供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号分别为110745-200415、110703-200424、110704-200420)。乙腈为色谱纯(德国默克公司)，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适应性试验
色谱柱：Kromasil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0 min(20∶80)-20 min (40∶60)-30 min(20∶80)；流速：1 mL/min；检测波长：203 nm， 进样量：10 μL；柱温：30 ℃。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，对照品溶液与供试品溶液依次出现3个峰：三七皂苷R1(保留时间7.45 min)、人参皂苷Rg1(保留时间8.54 min)、人参皂苷Rb1(保留时间16.73 min)，理论板数按人参皂苷Rg1峰计算不低于8 000，3组分理论板数均在7 000以上。此条件下对照品、供试品色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
取经60 ℃减压干燥2 h的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每1 mL中含三七皂苷R1 0.08 mg、人参皂苷Rg1 0.1 mg、人参皂苷Rb1 0.1 mg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取抗瘤丸，研细，取1 g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚适量，置水浴上回流2 h，弃去乙醚液，取出滤纸筒挥尽乙醚，药渣转移至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
2.4 阴性溶液的制备
按抗瘤丸处方和置备工艺制备缺三七药材的阴性对照样品，依“2.3”项下方法制备阴性对照品溶液，备用。
2.5 线性关系的考察
精密吸取“2.2”项下对照品混和溶液1、2、4、5、7.5 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取10 μL，依次进样，测定峰面积积分值。以色谱峰面积为纵坐标(Y)，以进样浓度(μg/mL)为横坐标(X)，进行回归分析。结果三七皂苷R1曲线方程为：Y＝27.131 5X－0.406 642(r＝0.999 9，n＝6)，在82.8～621 μg/mL范围内线性关系良好；人参皂苷Rg1曲线方程为：Y＝33.135 7X－19.473 7(r＝0.999 6，n＝6)，在109.8～823.5 μg/mL范围内线性关系良好；人参皂苷Rb1曲线方程为：Y＝24.417 2X＋22.076 4(r＝0.999 9，n＝6)，在112.6～844.5 μg/mL范围内线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样5次，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.38%、0.22%、0.38%，结果表明精密度良好。
2.7 稳定性试验
精密吸取对照品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.34%、0.20%、0.34%(n＝6)。结果表明对照品在制备后12 h内稳定。
2.8 重复性试验
精密称取同一样品(批号20061031)的样品5份，依“2.3”项下方法制备供试品溶液并按“2.1”项下色谱条件测定。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.33%、2.28%、2.76%。
2.9 阴性对照试验
精密吸取阴性对照液，按“2.1”项下色谱条件测定，在三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1处无吸收蜂，表明抗瘤丸中的其它成分对三七成分的测定不干扰。
2.10 加样回收率试验
精密称取同一批已知含量的本品研匀，精密加入一定量的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，依“2.3”项下方法制备，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1～表3。表1 三七皂苷R1回收率试验结果(略)表2 人参皂苷Rg1回收率试验结果(略)表3 人参皂苷Rb1回收率试验结果(略)
2.11 样品含量测定
取不同批号的供试品，依“2.3”项下方法制备，并按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表4。表4 样品含量测定结果(略)
3 讨论
3.1 提取方法的选择
本品组方较大，提取方法的选择非常重要。通过查阅文献，提取三七皂苷的基本方法有乙醚除脂、甲醇提取、水饱和的正丁醇和氨试液萃取[1]，此方法提取繁琐，所用试剂较多，耗时。有大孔树脂的方法[2]，但对被测成分有损失，且耗时，不适合此实验。通过几种方法的比较最后确定：乙醚回流2 h，甲醇超声提取。此方法简便快捷，提取有效率高，节省时间，节约试剂。
3.2 流动相的选择
关于HPLC测定三七中皂苷类成分的含量方法，文献报道较多。《中华人民共和国药典》中人参皂苷Rg1等含量测定采用乙腈-0.05%磷酸溶液(99∶400)[3]，文献[4]采用甲醇-水(72∶28)为流动相系统，结果三七皂苷均不能达到基线分离。在实验的研究过程中通过采用不同比例的乙腈-0.05%磷酸溶液[5-6]、乙腈-水[7]或甲醇-水[8]梯度洗脱，用乙腈-水[8-9]或乙腈- 0.05%磷酸溶液梯度洗脱[10]等，结果表明，以乙腈-0.05%磷酸溶液0 min(20∶80)-20 min(40∶60)-30 min(20∶80)为流动相，三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1峰的相对保留时间适中，分离效果较好。
本试验建立了HPLC法测定抗瘤丸中三七总皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量的方法[11]，简便、准确、重现性好，为制定该制剂质量标准提供了依据。
参考文献
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