作者：曾年菊 梁清华 熊新贵 区健刚
萧梅芳 张雨星 梁相辉 赵艳 杨波 刘维
【摘要】 ：目的 应用比较蛋白质组学方法分析并鉴定脑梗死肝阳化风证和阴虚生风证的相关蛋白质，探讨中医肝阳化风证及阴虚生风证的本质内涵。方法 设计选择脑梗死肝阳化风证、阴虚生风证患者及健康人各15例，提取外周静脉血淋巴细胞总蛋白质，经双向凝胶电泳，考马斯亮蓝染色获取凝胶图谱，PDQuest V7.3.1软件比较分析3组双向凝胶电泳图谱并识别差异表达蛋白质，对有意义的蛋白进行质谱分析和数据库检索鉴定。结果 经比较分析，发现肝阳化风证组与阴虚生风证组差异蛋白质点23个，鉴定出22个共15种蛋白质，相同表达蛋白质点8个，鉴定出6个蛋白质点共5种蛋白质。包括代谢酶类、信号传导蛋白、细胞骨架蛋白、抗氧化蛋白等多类蛋白质表达异常。结论 脑梗死肝阳化风证与阴虚生风证具有相同蛋白和差异蛋白，提示二者具有相同的物质基础和不同的本质内涵。
【关键词】 肝阳化风证 脑梗死 质谱分析 蛋白质组学
Abstract：Objective To analyze and identify the proteins relevant to Ganyang Huafeng Syndrome (GYHF) and Yinxu Shengfeng Syndrome (YXSF) of cerebral infarction， and investigate the essence of GYHF and YXSF. Methods 3 groups， GYHF of cerebral infarction， YXSF of cerebral infarction and healthy people were designed with 15 cases of each group. Total protein were extracted from lymphocyte of peripheral venous blood， and two dimensional electrophoresis was used to separate total proteins from norma land model ratsynovium. Having been stained， proteins were analyzed by PDquest software. Some selected protein spots were identified by peptide mass fingerprint (PMF) based on Matrix assisted laser desorption/ ionizationtime of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) and database. Results 23 different protein spots and 8 identical peotein spots were found out from GYHF and YXSF group， 22 proteins were identified from the different protein spots including 15 kinds of proteins and 6 protein spots including 5 kinds of proteins. GYHF of cerebral infarction related with proteins such as metabolic enzymes， signal transmission proteins， cytoskeletal protein， antioxydation proteins and so forth. Conclusion GYHF and YXSF of cerebral infarction have different proteins and identical proteins， which indicates that the two syndromes have the same matter substructure and different essential connotation.
Key words：Ganyang Huafeng Syndrome；cerebral infarction；MALDI-TOF-MS；proteromics
随着后基因时代的到来，蛋白质组学广泛应用于医学研究，并逐渐渗入到中医领域。近年来，中医证实质的蛋白质组学研究成为热点[1]，并提出证候蛋白质组学。在证候理论指导下，运用功能蛋白质组学的方法，通过探讨证候，特别是同病异证或异病同证的蛋白质差异表达及翻译后的修饰情况，揭示与某一证候形成相关的所有蛋白质及其特征，在整体蛋白质表达的水平上阐明证候的本质，则可称为证候蛋白质组学。建立“证候-蛋白质表达谱”，以此来揭示中医证候的内涵，能够为中医辨证的客观化提供依据和方法。通过对异病同证和同病异证的研究，确定某一证候时特异表达的基因和蛋白质，建立该证候的总体基因和蛋白质表达谱。本研究运用蛋白质组的二维凝胶电泳、质谱鉴定等技术，研究肝阳化风证的证实质，通过本所对中医肝病证候的流行病学调查及研究，肝阳化风证涉及的13个病种，脑梗死占52%，脑溢血占29.60%[2-3]，为此，我们采用脑梗死肝阳化风证作为研究对象。
1 研究对象和方法
1.1 外周血淋巴细胞的分离和细胞总蛋白质的提取
选择符合1995年全国第四届脑血管病学术会议通过的脑梗死疾病诊断标准及中医肝阳化风证、阴虚生风证辨证标准的患者各15例[2，4]及15名健康志愿者，抽取空腹外周静脉血10 mL，参照文献[5]方法并加以改良，分离血清淋巴细胞，于-70 ℃低温干冻保存。称50～60 mg淋巴细胞，加入80 μL细胞裂解液，混合液氮反复研磨，并在震荡仪上震荡使充分溶解，涡旋混匀， 12 000 r/min、4 ℃离心1 h，取上清即为细胞总蛋白质。取5 μL分装待测，余样品保存至-70 ℃，用bradford 法BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度[6-7]。
1.2 胶内酶解和质谱分析
挖取差异表达的蛋白质点置于1.5 mL的Eppendorf管中，质谱步骤见表1。将干燥的样品与基质(α-氰基-β-羟基肉桂酸)溶液充分混匀后点样于不锈钢样本靶上，室温晾干后，Voyager- DE STR MALDI-TOF-MS质谱仪进行肽质量指纹谱的鉴定，获得肽片段质量指纹图谱，由www.matrixscience.com在Swiss-prot数据库搜索进行蛋白鉴定，使用的检索软件为matrixscience公司提供的免费肽质量指纹图谱Mascot检索软件。表1 胶内酶解过程（略）
1.3 二维电泳和图像分析
参考Amersham公司二维凝胶电泳手册进行。采用24 cm、pH 7～10 IPG预制干胶条，蛋白质上样量均为1 000 μg，二维电泳凝胶采用考马斯亮蓝显色，PDQuest V7.3.1软件行蛋白质斑点检测和分析，蛋白质表达水平上升或下调200%的点为差异点(大于300%为显著差异点)，进行鉴定。
2 结果
2.1 脑梗死肝阳化风证二维凝胶电泳图像分析
每组总蛋白质重复检测3次，其二维电泳图谱非常相似，Image Scanner 扫描后，用PDQuest V7.3.1分析软件可以检测肝阳化风证组459个蛋白质斑点，健康组552个，阴虚生风证组644个。肝阳化风证组与健康对照组比较，发现差异蛋白质点21个；阴虚生风组与健康对照组比较，发现差异蛋白质点29个；肝阳化风证差异图谱与阴虚生风证差异图谱比较，分析发现23个差异蛋白质点，8个相同蛋白质点(见表2)。表2 差异蛋白质在各组表达情况（略）注：0，正常；无，缺失点；-，2组比较无差别；↑，上调200%；↑↑，上调300%以上；↓，下调200%；↓↓，下调300%以上
2.2 差异蛋白质点的质谱鉴定
我们对差异显示蛋白质斑点用trypsin进行胶内酶切， MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹谱，在www.matrixscience.com网站上，利用MASCOT软件检索Swissprot蛋白质数据库进行鉴定，共鉴定出27个蛋白质斑点，共20种蛋白质。各种蛋白质点在3组的表达各异，经肝阳化风组与健康对照组、阴虚生风组与健康对照组，以及肝阳化风组与阴虚生风组的相互比较，发现肝阳化风组与阴虚生风组差异蛋白质点23个，鉴定出22个共15种蛋白质，分别为成帽蛋白、血小板凝血酶敏感蛋白-1、腺苷酰环化酶联合蛋白-1、鸟苷二磷酸解离抑制因子2、γ-肌动蛋白、钙结合蛋白、肌球蛋白调节轻链、抗增殖蛋白、谷胱甘肽转移酶ω-１、硫氧还蛋白过氧(化)物酶-1、Visual cortex cDNA、假想蛋白、Ras抑制蛋白、受体相关蛋白/RNA聚合酶相关蛋白、锌结合蛋白；相同表达蛋白质点8个，鉴定出6个蛋白质点共5种蛋白质，分别为核内不均一核糖核蛋白、丝氨酸/苏氨酸特异蛋白激酶、踝蛋白、纤维蛋白素原β-链前体、纤维蛋白素原α链前体(见表3)。表3 差异表达蛋白检测结果（略）
3 讨论
一般肝阳化风证多见于中风病的急性期；而气虚血瘀证、阴虚风动证多见于中风病恢复期或后遗症期。现代研究发现，肝阳化风时，机体处于应激状态；血浆收缩血管活性物质显著增加，舒张血管活性物质含量下降[8]。肝阳化风证血NE、E及血浆血质醇(F)含量显著升高[9]。脑梗死缺血再灌注后所造成的脑组织损伤则不仅仅取决于血流，还与细胞内Ca2+超载、自由基连锁反应、兴奋性氨基酸的神经毒性作用、NO的细胞毒作用、氨基酸代谢失衡及基因表达与蛋白质的磷酸化、缺血区的各种代谢以及水与酸碱平衡紊乱等因素有关。早在l979年， Czlonkowska A等[10]就发现急性脑梗死外周血淋巴细胞总数减少并且T淋巴细胞同时减少，并认为与应激有关，免疫功能的损害使患者容易合并感染。Gendron A[11]报道，左右大脑皮质不同部位的损害在免疫反应中发挥的作用不同，同时对淋巴细胞变化进行了进一步的分类。对Wister鼠大脑中动脉阻断模型(MCAO)观察发现，缺血急件期脾脏淋巴细胞总数显著减少、淋巴细胞的增生和分化增强、外周血中淋巴细胞总数显著减少、不同亚型的变化不一致，认为脑梗死缺血病灶的淋巴细胞来源于外周血。Campanella M等[12]运用流式细胞技术对脑梗死小鼠脑组织进行细胞分离后检测发现淋巴细胞显著增加。进一步说明外周血T淋巴细胞的减少可能是由于大量进入中枢所致。
腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase)是相对分子量为150KD的糖蛋白，跨膜12次。在Mg2+或Mn2+的存在下，腺苷酸环化酶催化ATP生成cAMP。腺苷酰环化酶联合蛋白-1(CAP-1)，直接调节丝状体动力学，并参与一系列复杂的发育和形态学过程，包括信使RNA定位和细胞极性的建立。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Pak)是Rho家族中GTP酶的重要效应物，它在细胞形态学和动力学以及细胞转化的调控方面起到了很重要的作用，它可以与Rho家族中的GTP酶结合。GTPases和PBD相互作用可使Paks的内在激酶活性脱抑制，从而导致活性环的自身磷酸化和全酶的激活。Paks作为GTPases的效应物，通过对肌动蛋白细胞构架的调节，在细胞形态学和动力学的调控上起到了重要的作用。肾上腺素及胰高血糖素等激素可使cAMP水平升高，本研究中，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶在肝阳化风组、阴虚生风组表达均下调，使得自身磷酸化和全酶的激活受到抑制；腺苷酰环化酶在肝阳化风组中表达缺失，阴虚生风组中表达明显下调，从而抑制催化ATP生成cAMP，使肝阳化风证应激状态趋于平衡。二者可能为应激负反馈调节蛋白，同时大量外周血淋巴细胞进入脑组织，使得二者在外周血淋巴细胞表达相应下调。
肌球蛋白(EC3613)，又称ATP磷酸水解酶，通过催化水解ATP提供肌肉收缩所需能量。不论是何种来源的肌球蛋白均由轻链和重链组成，其中轻链又分为调节轻链和必需轻链两种。肌球蛋白调节轻链可由肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)在Ca2+及钙调蛋白(calmodulin)存在时催化其磷酸化而导致肌动蛋白与肌球蛋白反应进而引发肌肉收缩。在平滑肌，肌球蛋白轻链起着重要的调节作用。细胞内Ca2+超载，高浓度的钙离子与钙调素形成复合物(Ca4·CaM)，使肌球蛋白轻链激酶从失活态变为活化态，转而催化肌球蛋白轻链磷酸化，肌球蛋白得与肌动蛋白相互作用，引起收缩。本研究中，肌球蛋白调节轻链肝阳化风组与健康对照组无明显变化，可能也是细胞应激状态负反馈调节蛋白，但在阴虚生风组显著上调，说明肌肉收缩。
硫氧还蛋白过氧化物酶1(Thioredoxinperoxidase 1)和细胞氧化还原反应的调节有关。通过硫氧还蛋白系统产生的能量还原过氧化超氧化物，除了在清除自由基方面有重要作用外，还通过调节细胞间h3O2浓度参与生长因子和肿瘤坏死因子alpha的信号调节机制，肌动蛋白启动子能够指导硫氧还蛋白基因在脑组织中的表达。我们研究发现，在肝阳化风组中，硫氧还蛋白过氧(化)物酶-1在肝阳化风组中下降，在后期的阴虚生风组中表达上调，提示急性期机体处于氧化应激状态，大量氧自由基产生，从而该蛋白在清除氧自由基大量消耗，从而表达下降，而后期机体相对处于恢复过程，表达的上调表明脑缺血的修复过程。
谷胱甘肽S转移酶omega 1在肝阳化风组下调，提示脑缺血后清除氧自由基能力发生改变，而在阴虚生风组上调，表明后期的恢复过程。血小板凝血酶敏感蛋白是一种调节细胞-细胞间和细胞-基质间相互作用的粘着糖蛋白，可与纤维蛋白素原、纤维结合素、层粘连蛋白等结合。在脑梗死中，血小板粘附在血管壁并释放血浆纤维蛋白原(Fbg)水平增高可能是缺血性心脑血管病发病的一个重要危险因素。脑梗死患者存在血浆Fbg水平升高，纤维蛋白单体聚合率和Fbg功能增强现象[13]，本实验中，纤维蛋白素原α、纤维蛋白素原β在肝阳化风组、阴虚生风组皆上调，表明血小板功能增强伴有血小板超微结构的改变，导致血小板粘附和聚集性增强，形成血栓。从而提示，在脑梗死的治疗过程中，不管辨证是肝阳化风证还是阴虚生风证，除注意平肝潜阳、养阴熄风外，还应佐以活血化瘀。本实验中，发现的2个假想、2个未知蛋白，其在肝阳化风中的影响还有待进一步探索。
本研究成功寻找并鉴定了脑梗死肝阳化风证、阴虚生风证的相关蛋白质，下一步将从以下两方面深入研究：应用或等技术进一步验证蛋白质组筛选出的相关蛋白；从异病同证角度，比较研究肝阳化风证的常见疾病，寻找出其共同的蛋白质，从蛋白质组学角度揭示肝阳化风证的证本质。
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