作者：何玉伟 李晓泓 张露芬 解秸萍
翟景慧 周军 周登芳 郑玲 曲黎敏 田阳春
【摘要】 ：目的 探讨逆针关元穴对自然更年期大鼠血清、子宫的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)和脾脏白细胞介素-2受体mRNA(IL-2R mRNA)的影响及其机制。方法 将112只已经通过阴道涂片筛查的10月龄SD雌性大鼠随机分为7组，另3.5月龄1组16只。采用放射免疫、原位杂交等方法，观察10月龄逆针关元穴(2次/周，连续8周)对随后12、14、16月龄大鼠血清、子宫的细胞因子IL-2、TNF、TGF和脾脏IL-2R mRNA的影响。结果 与自然年轻组相比，模型对照各组血清和子宫IL-2、TGF及子宫TNF均下降，血清TNF水平呈先降后升的波动性变化，脾脏IL-2R mRNA表达水平下降；而预先介入逆针疗法后，与自然同月龄组相比，逆针各组血清和子宫IL-2、TGF及子宫TNF上升，其中逆针14、16月龄组血清TGF，逆针12、16月龄组子宫IL-2，逆针12月龄组子宫TNF和逆针12、16月龄组子宫TGF均明显提高(P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01，P&<0.05，P&<0.01， P&<0.05，P&<0.05)。血清TNF水平与模型对照组呈相反的波动性变化，其中逆针12、14月龄组差异显著(均P&<0.05)。脾脏IL-2R mRNA上调，其中逆针14月龄差异显著(P&<0.05)。结论 逆针关元穴可以调节随后更年期大鼠血清和子宫的细胞因子IL-2、TNF、TGF水平和脾脏IL-2R mRNA的表达，这可能是该疗法改善更年期免疫功能的机制之一。
【关键词】 逆针 关元穴 自然更年期大鼠 白细胞介素-2 肿瘤坏死因子 转化生长因子 白细胞介素-2受体mRNA
Abstract：Objective To observe the effect on IL-2， TNF， TGF in uterus and serum， and IL-2RmRNA in spleen of menopausal rats with preventive accupuncture on Guanyuan point， and analysis the mechanism. Methods 112 ten month-aged SD female rats examined by vaginal smear were chosen and pided into seven groups. And another 16 three point five month-aged SD female rats were another group. Radio-immunity and hybridiztion in situ methods were applied to observe the effect on IL-2， TNF， TGF in uterus and serum and IL-2R mRNA in spleen of 12， 14 and 16 month-aged menopausal rats with preventive accupuncture on Guanyuan point (twice a week， eight weeks continued) in 10th month. Results Compared with the normal group， IL-2， TGF in uterus and serum and TNF in uterus of menopausal rats reduced， TNF in serum came down in the 12th month and went up in 14th and 16th month， IL-2R mRNA in spleen decreased. Compared with the same-aged model group， IL-2， TGF of serum and uterus and TNF in uterus increased. TGF in serum of 14 and 16 month-aged group， IL-2 in uterus of 12 and 16 month-aged group， TNF in uterus of 12 month-aged group and TGF in uterus of 12 and 16 month-aged group rised significantly (P&<0.05 or P&<0.01). TNF in serum presented a converse wave-like change and it increased apparently of the 12 and 14 month-aged group (P&<0.05). IL-2R mRNA increased with preventive acupuncture and it went up distinctly in the 14th month (P&<0.05). Conclusion Preventive accupuncture on Guanyuan point can improve the immunologic function of menopausal rats， which is probably related to the dominating of IL-2， TNF and TGF in serum and uterus， and IL-2R mRNA in spleen.
Key words：preventive accupuncture；natrual menopausal rats；immunity；IL-2；TNF；TGF；IL-2R mRNA
逆针是指在机体无病或疾病发生之前预先应用针刺方法提高机体应激与耐受能力，从而防止疾病的发生、减轻随后疾病的损害和保健延年的一种方法。更年期是妇女走向衰老的重要转折点，此期机体的神经、内分泌整体性失调，免疫功能亦趋向于紊乱。本实验结合以往的研究[1-2]，采用在更年期之前逆针关元穴的方法，观察其对随后自然更年期大鼠血清、子宫的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)和脾脏白细胞介素-2受体mRNA(IL-2R mRNA)的影响，以进一步探讨该疗法对更年期免疫功能的调节机制。
1 材料与方法
1.1 动物及模型制备
根据实验动物生命阶段划分法，选中年后期9.5月龄SD雌性大鼠，通过阴道涂片法[3]，即每日定时将大鼠的阴道涂片用碱性美蓝溶液染色后在显微镜下观察其组织学变化，连续观察3个动情周期(15 d，从9.5月龄至10月龄)。根据细胞形态、种类及数量筛选已开始出现动情周期紊乱(预示即将或开始进入更年期)的大鼠112只，体重(300±20)g，纳入本实验，将其随后的12～16月龄作为自然老化鼠更年期模型。另选健康SD雌性大鼠3.5月龄16只，体重(240±20)g。所用SD雌性大鼠均为清洁级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK (京)2002-0003]。
1.2 分组
将经过阴道涂片筛选出开始出现动情周期紊乱10月龄SD雌性大鼠112只，按照随机数字法[4]分为7组，每组16只，其中3个逆针组(12、14、16月龄逆针组)，3个模型对照组(12、14、16月龄对照组)，1个10月龄对照组。另选健康SD雌性大鼠3.5月龄16只，体重(240±20)g，为自然年轻组。共8组，同等条件下饲养。
1.3 仪器及试剂
仪器：GC-911-γ-放射免疫计数器；ER-182A型电子天平(日本)；电热恒温水浴箱；ZK380型低温离心机(德国)；DY89-1型电子玻璃匀浆机；美国MIS-2000 SP型3Y显微图像分析仪；3Y分析软件(Pro，Ver.4.0)；日产Nikon H8-202 AN；Polariod 数码显微摄像机。
试剂：IL-2、TNF、TGF放免试剂盒购自北京华英生物技术研究所；IL-2R mRNA原位杂交探针、试剂盒均购自中山试剂公司。
1.4 逆针组及模型对照组的处理方法
所有逆针组大鼠均在10月龄开始针刺，方法为轻抓大鼠让其仰躺在手掌上，待其安静后，取关元穴(鼠后肢根部在下腹连线的中点)下约2分处将针直刺2分，后斜向上刺入，留针20 min。留针过程中让大鼠处于自由状态。每周针2次，共针8周。自然年轻组、模型对照组及10月龄对照组除象逆针组轻抓仰躺外不作任何处理。
1.5 取材及样品基础处理
每组大鼠取10只进行指标检测。各组大鼠断头取血，室温血液自然凝固15 min后，2 500 r/min离心20 min，取上清，-70 ℃保存待测。冰上迅速摘取左侧子宫，在生理盐水中煮沸5 min称重，置于玻璃匀浆管中，加入1 mol/L HCL 1 mL，于冰上在匀浆机上进行匀浆，充分匀浆后室温放置100 min，加入1 mol/L NaOH 0.8 mL 中和至一定的pH值，3 500 r/min离心15 min，取上清，-70 ℃保存待测。每组余6只应用蓝格蠕动泵经左心室到主动脉进行灌注，先用生理盐水冲洗，再用4%多聚甲醛磷酸缓冲液初步固定，然后取出大鼠脾脏组织，放在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中继续固定，一定时间后进行包埋、切片(5～6 μm)。
1.6 指标检测
血清、子宫IL-2、TNF、TGF水平检测：采用放射免疫法，测定方法严格按试剂盒说明书操作程序操作；脾脏IL-2R mRNA水平检测：取脾脏的石蜡切片进行分子原位杂交，脱水，封片，采用美国Image-Pro·. Plus Version4.5.1图像分析软件，计算吸光度(IOD)值。
1.7 统计学方法
所有数据以x±s表示。各组组间差异采用方差分析，以P&<0.05、P&<0.01作为显著性差异和极显著性差异的标准。
2 结果
(见表1～表3) 表1 逆针前后自然更年期大鼠血清IL-2、TNF、TGF的变化(略)注：与自然年轻组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与自然同月龄组比较，▲P&<0.05，▲▲P&<0.01(下同)表2 逆针前后自然更年期大鼠子宫IL-2、TNF、TGF的变化(略)表3 逆针前后自然更年期大鼠脾脏IL-2R mRNA表达水平(IOD)的变化(略)
3 讨论
更年期是妇女走向衰老的关键启动期，此期机体的神经内分泌失调的同时，免疫因子及免疫功能也出现紊乱[5-6]。本研究选取自然老化大鼠更年期模型，并以阴道涂片筛查法确保了模型的统一性。结果发现：大鼠进入更年期后，血清和子宫IL-2、TGF，子宫TNF及脾脏IL-2R mRNA表达水平均下降，血清TNF水平呈先降后升的波动性变化，与文献报道基本一致[7-9]。提示更年期大鼠机体已处于免疫失调状态。而于10月龄介入逆针关元穴(2次/周，连续8周)的方法，可使同期大鼠血清、子宫的细胞因子出现良性调节的趋势：血清和子宫IL-2、TGF和子宫TNF的水平大体上呈上调趋势，血清TNF水平呈与同龄对照组相反的波动性变化。说明逆针关元穴，可对随后的更年期血清、子宫的细胞因子产生影响，使之维持在适当的水平，进而通过促进免疫细胞的增值分化、提高免疫细胞的活性、诱导肿瘤细胞的凋亡等途径发挥更年期免疫功能的保护作用。逆针对IL-2、TGF、TNF的调节作用主要体现在逆针12、16月龄，14月龄变化多不明显，说明逆针有一定的即时效应和累积效应(逆针从10月龄开始，持续8周，即逆针结束时约相当于大鼠的12月龄)。与自然同月龄对照组相比，逆针后脾脏IL-2R mRNA表达水平均升高，提示逆针可以通过提高具有免疫调节功能的细胞因子受体基因表达来改善机体的免疫失调。但与对细胞因子的影响不同的是，逆针后脾脏IL-2R mRNA表达水平14月龄差异显著，这也从一定程度上说明了基因优先于蛋白表达，14月龄IL-2R mRNA表达水平的显著提高可能是16月龄累积效应的潜在力量。但逆针关元穴究竟通过什么内在的级联信息影响这些细胞因子的确切机制有待进一步研究证明。
参考文献
[1] 李晓泓，解秸萍.逆灸关元穴对不同月龄更年期大鼠肿瘤坏死因子-α及脾脏雌激素受体-α的影响[J].中国临床康复，2006，10(43)：171－173.
[2] 李晓泓，解秸萍，张露芬，等.逆灸对自然更年期大鼠子宫组织形态及E2、P和ER-α影响的实验研究[J].北京中医药大学学报，2006，29(8)：558－561.
[3] 施新遒.现代医学实验动物学[M].北京：人民军医出版社，2000.330－332.
[4] 孙振球.医学统计学[M].北京：人民卫生出版社，2002.540.
[5] Paganelli R， Di Iorio A， Cherubini A， et al. Frailty of older age：the role of the endocrine-immune interaction[J].Curr Pharm Des，2006，12(24)：3147－3159.
[6] Ryan-Borchers TA， Park JS， Chew BP， et al. Soy isoflavones modulate immune function in healthy postmenopausal women[J].Am J Clin Nutr，2006，83(5)：1118－1125.
[7] 林燕萍，周瑞祥，王和鸣，等.健骨颗粒对去卵巢骨质疏松模型鼠血清肿瘤坏死因子α及转化生长因子β的影响[J].中国临床康复，2005，9(34)：187－189.
[8] 杨明华，杨苏蓓，龙 森，等.坤怡宁对雌性去卵巢大鼠生殖内分泌-免疫的影响[J].中国中药杂志，2006，31(13)：1107－1109.
[9] 王 敏，王 平，洪小平，等.从IL-2及其受体表达探讨党参在延缓衰老中的作用[J].中华中医药杂志，2006，21(10)：629－630.
【摘要】 ：目的 探讨逆针关元穴对自然更年期大鼠血清、子宫的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)和脾脏白细胞介素-2受体mRNA(IL-2R mRNA)的影响及其机制。方法 将112只已经通过阴道涂片筛查的10月龄SD雌性大鼠随机分为7组，另3.5月龄1组16只。采用放射免疫、原位杂交等方法，观察10月龄逆针关元穴(2次/周，连续8周)对随后12、14、16月龄大鼠血清、子宫的细胞因子IL-2、TNF、TGF和脾脏IL-2R mRNA的影响。结果 与自然年轻组相比，模型对照各组血清和子宫IL-2、TGF及子宫TNF均下降，血清TNF水平呈先降后升的波动性变化，脾脏IL-2R mRNA表达水平下降；而预先介入逆针疗法后，与自然同月龄组相比，逆针各组血清和子宫IL-2、TGF及子宫TNF上升，其中逆针14、16月龄组血清TGF，逆针12、16月龄组子宫IL-2，逆针12月龄组子宫TNF和逆针12、16月龄组子宫TGF均明显提高(P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01，P&<0.05，P&<0.01， P&<0.05，P&<0.05)。血清TNF水平与模型对照组呈相反的波动性变化，其中逆针12、14月龄组差异显著(均P&<0.05)。脾脏IL-2R mRNA上调，其中逆针14月龄差异显著(P&<0.05)。结论 逆针关元穴可以调节随后更年期大鼠血清和子宫的细胞因子IL-2、TNF、TGF水平和脾脏IL-2R mRNA的表达，这可能是该疗法改善更年期免疫功能的机制之一。
【关键词】 逆针 关元穴 自然更年期大鼠 白细胞介素-2 肿瘤坏死因子 转化生长因子 白细胞介素-2受体mRNA
Changes of IL-2， TNF， TGF and IL-2R mRNA of Menopausal Rats and Effects of Preventive Acupuncture on Guanyuan Point
HE Yu-wei， LI Xiao-hong， ZHANG Lu-fen， et al
Beijing University of TCM， Beijing 100029， China
Abstract：Objective To observe the effect on IL-2， TNF， TGF in uterus and serum， and IL-2RmRNA in spleen of menopausal rats with preventive accupuncture on Guanyuan point， and analysis the mechanism. Methods 112 ten month-aged SD female rats examined by vaginal smear were chosen and pided into seven groups. And another 16 three point five month-aged SD female rats were another group. Radio-immunity and hybridiztion in situ methods were applied to observe the effect on IL-2， TNF， TGF in uterus and serum and IL-2R mRNA in spleen of 12， 14 and 16 month-aged menopausal rats with preventive accupuncture on Guanyuan point (twice a week， eight weeks continued) in 10th month. Results Compared with the normal group， IL-2， TGF in uterus and serum and TNF in uterus of menopausal rats reduced， TNF in serum came down in the 12th month and went up in 14th and 16th month， IL-2R mRNA in spleen decreased. Compared with the same-aged model group， IL-2， TGF of serum and uterus and TNF in uterus increased. TGF in serum of 14 and 16 month-aged group， IL-2 in uterus of 12 and 16 month-aged group， TNF in uterus of 12 month-aged group and TGF in uterus of 12 and 16 month-aged group rised significantly (P&<0.05 or P&<0.01). TNF in serum presented a converse wave-like change and it increased apparently of the 12 and 14 month-aged group (P&<0.05). IL-2R mRNA increased with preventive acupuncture and it went up distinctly in the 14th month (P&<0.05). Conclusion Preventive accupuncture on Guanyuan point can improve the immunologic function of menopausal rats， which is probably related to the dominating of IL-2， TNF and TGF in serum and uterus， and IL-2R mRNA in spleen.
Key words：preventive accupuncture；natrual menopausal rats；immunity；IL-2；TNF；TGF；IL-2R mRNA
逆针是指在机体无病或疾病发生之前预先应用针刺方法提高机体应激与耐受能力，从而防止疾病的发生、减轻随后疾病的损害和保健延年的一种方法。更年期是妇女走向衰老的重要转折点，此期机体的神经、内分泌整体性失调，免疫功能亦趋向于紊乱。本实验结合以往的研究[1-2]，采用在更年期之前逆针关元穴的方法，观察其对随后自然更年期大鼠血清、子宫的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)和脾脏白细胞介素-2受体mRNA(IL-2R mRNA)的影响，以进一步探讨该疗法对更年期免疫功能的调节机制。
1 材料与方法
1.1 动物及模型制备
根据实验动物生命阶段划分法，选中年后期9.5月龄SD雌性大鼠，通过阴道涂片法[3]，即每日定时将大鼠的阴道涂片用碱性美蓝溶液染色后在显微镜下观察其组织学变化，连续观察3个动情周期(15 d，从9.5月龄至10月龄)。根据细胞形态、种类及数量筛选已开始出现动情周期紊乱(预示即将或开始进入更年期)的大鼠112只，体重(300±20)g，纳入本实验，将其随后的12～16月龄作为自然老化鼠更年期模型。另选健康SD雌性大鼠3.5月龄16只，体重(240±20)g。所用SD雌性大鼠均为清洁级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK (京)2002-0003]。
1.2 分组
将经过阴道涂片筛选出开始出现动情周期紊乱10月龄SD雌性大鼠112只，按照随机数字法[4]分为7组，每组16只，其中3个逆针组(12、14、16月龄逆针组)，3个模型对照组(12、14、16月龄对照组)，1个10月龄对照组。另选健康SD雌性大鼠3.5月龄16只，体重(240±20)g，为自然年轻组。共8组，同等条件下饲养。
1.3 仪器及试剂
仪器：GC-911-γ-放射免疫计数器；ER-182A型电子天平(日本)；电热恒温水浴箱；ZK380型低温离心机(德国)；DY89-1型电子玻璃匀浆机；美国MIS-2000 SP型3Y显微图像分析仪；3Y分析软件(Pro，Ver.4.0)；日产Nikon H8-202 AN；Polariod 数码显微摄像机。
试剂：IL-2、TNF、TGF放免试剂盒购自北京华英生物技术研究所；IL-2R mRNA原位杂交探针、试剂盒均购自中山试剂公司。
1.4 逆针组及模型对照组的处理方法
所有逆针组大鼠均在10月龄开始针刺，方法为轻抓大鼠让其仰躺在手掌上，待其安静后，取关元穴(鼠后肢根部在下腹连线的中点)下约2分处将针直刺2分，后斜向上刺入，留针20 min。留针过程中让大鼠处于自由状态。每周针2次，共针8周。自然年轻组、模型对照组及10月龄对照组除象逆针组轻抓仰躺外不作任何处理。
1.5 取材及样品基础处理
每组大鼠取10只进行指标检测。各组大鼠断头取血，室温血液自然凝固15 min后，2 500 r/min离心20 min，取上清，-70 ℃保存待测。冰上迅速摘取左侧子宫，在生理盐水中煮沸5 min称重，置于玻璃匀浆管中，加入1 mol/L HCL 1 mL，于冰上在匀浆机上进行匀浆，充分匀浆后室温放置100 min，加入1 mol/L NaOH 0.8 mL 中和至一定的pH值，3 500 r/min离心15 min，取上清，-70 ℃保存待测。每组余6只应用蓝格蠕动泵经左心室到主动脉进行灌注，先用生理盐水冲洗，再用4%多聚甲醛磷酸缓冲液初步固定，然后取出大鼠脾脏组织，放在4%多聚甲醛磷酸缓冲液中继续固定，一定时间后进行包埋、切片(5～6 μm)。
1.6 指标检测
血清、子宫IL-2、TNF、TGF水平检测：采用放射免疫法，测定方法严格按试剂盒说明书操作程序操作；脾脏IL-2R mRNA水平检测：取脾脏的石蜡切片进行分子原位杂交，脱水，封片，采用美国Image-Pro·. Plus Version4.5.1图像分析软件，计算吸光度(IOD)值。
1.7 统计学方法
所有数据以x±s表示。各组组间差异采用方差分析，以P&<0.05、P&<0.01作为显著性差异和极显著性差异的标准。
2 结果
(见表1～表3) 表1 逆针前后自然更年期大鼠血清IL-2、TNF、TGF的变化(略)注：与自然年轻组比较，*P&<0.05，**P&<0.01；与自然同月龄组比较，▲P&<0.05，▲▲P&<0.01(下同)表2 逆针前后自然更年期大鼠子宫IL-2、TNF、TGF的变化(略)表3 逆针前后自然更年期大鼠脾脏IL-2R mRNA表达水平(IOD)的变化(略)
3 讨论
更年期是妇女走向衰老的关键启动期，此期机体的神经内分泌失调的同时，免疫因子及免疫功能也出现紊乱[5-6]。本研究选取自然老化大鼠更年期模型，并以阴道涂片筛查法确保了模型的统一性。结果发现：大鼠进入更年期后，血清和子宫IL-2、TGF，子宫TNF及脾脏IL-2R mRNA表达水平均下降，血清TNF水平呈先降后升的波动性变化，与文献报道基本一致[7-9]。提示更年期大鼠机体已处于免疫失调状态。而于10月龄介入逆针关元穴(2次/周，连续8周)的方法，可使同期大鼠血清、子宫的细胞因子出现良性调节的趋势：血清和子宫IL-2、TGF和子宫TNF的水平大体上呈上调趋势，血清TNF水平呈与同龄对照组相反的波动性变化。说明逆针关元穴，可对随后的更年期血清、子宫的细胞因子产生影响，使之维持在适当的水平，进而通过促进免疫细胞的增值分化、提高免疫细胞的活性、诱导肿瘤细胞的凋亡等途径发挥更年期免疫功能的保护作用。逆针对IL-2、TGF、TNF的调节作用主要体现在逆针12、16月龄，14月龄变化多不明显，说明逆针有一定的即时效应和累积效应(逆针从10月龄开始，持续8周，即逆针结束时约相当于大鼠的12月龄)。与自然同月龄对照组相比，逆针后脾脏IL-2R mRNA表达水平均升高，提示逆针可以通过提高具有免疫调节功能的细胞因子受体基因表达来改善机体的免疫失调。但与对细胞因子的影响不同的是，逆针后脾脏IL-2R mRNA表达水平14月龄差异显著，这也从一定程度上说明了基因优先于蛋白表达，14月龄IL-2R mRNA表达水平的显著提高可能是16月龄累积效应的潜在力量。但逆针关元穴究竟通过什么内在的级联信息影响这些细胞因子的确切机制有待进一步研究证明。
参考文献
[1] 李晓泓，解秸萍.逆灸关元穴对不同月龄更年期大鼠肿瘤坏死因子-α及脾脏雌激素受体-α的影响[J].中国临床康复，2006，10(43)：171－173.
[2] 李晓泓，解秸萍，张露芬，等.逆灸对自然更年期大鼠子宫组织形态及E2、P和ER-α影响的实验研究[J].北京中医药大学学报，2006，29(8)：558－561.
[3] 施新遒.现代医学实验动物学[M].北京：人民军医出版社，2000.330－332.
[4] 孙振球.医学统计学[M].北京：人民卫生出版社，2002.540.
[5] Paganelli R， Di Iorio A， Cherubini A， et al. Frailty of older age：the role of the endocrine-immune interaction[J].Curr Pharm Des，2006，12(24)：3147－3159.
[6] Ryan-Borchers TA， Park JS， Chew BP， et al. Soy isoflavones modulate immune function in healthy postmenopausal women[J].Am J Clin Nutr，2006，83(5)：1118－1125.
[7] 林燕萍，周瑞祥，王和鸣，等.健骨颗粒对去卵巢骨质疏松模型鼠血清肿瘤坏死因子α及转化生长因子β的影响[J].中国临床康复，2005，9(34)：187－189.
[8] 杨明华，杨苏蓓，龙 森，等.坤怡宁对雌性去卵巢大鼠生殖内分泌-免疫的影响[J].中国中药杂志，2006，31(13)：1107－1109.
[9] 王 敏，王 平，洪小平，等.从IL-2及其受体表达探讨党参在延缓衰老中的作用[J].中华中医药杂志，2006，21(10)：629－630.