作者：黄烨 王宗仁 解娟 王跃民 李军昌 马静
【摘要】 ：目的 观察益气活血复方芪丹通脉片对心肌缺血/再灌注大鼠血清白细胞介素-10(IL-10)含量的影响，探讨其心肌保护机制。方法 采用结扎左冠状动脉前降支方法制备大鼠心肌缺血/再灌注模型。36只健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、恬尔心组及芪丹通脉片高、中、低剂量组。缺血30 min，再灌注2 h，采全血，用ELISA法检测血清IL-10含量，用HE染色观察心肌病理形态学变化，并用透射电镜观察心肌组织超微结构变化。结果 芪丹通脉片高、中、低剂量组均可增加血清IL-10含量，减少炎性细胞浸润，减轻心肌超微结构损伤，其中高剂量组明显优于低剂量组，且与恬尔心组无显著差异。结论 益气活血复方芪丹通脉片可促进内源性IL-10大量释放，减少炎症反应，改善受损的心肌超微结构，发挥心肌保护作用。
【关键词】 芪丹通脉片 心肌缺血/再灌注损伤 炎症反应 白细胞介素-10 心肌超微结构 大鼠
Abstract：Objective To investigate the effects of Qi-reinforcing and blood-activating prescription， Qidan Tongmai Tablet (QDTMT) on the IL-10 in the rat model of myocardial ischemia/reperfusion injury. Methods A model of myocardial ischemia/reperfusion injury was reproduced by ligation of left anterior descending branch of the coronary artery. Thirty-six male SD rats were randomly pided into six groups (n＝6)：sham operation group， model group， Diltiazem Hydrochloride group， QDTMT high-dose group， QDTMT medium-dose group and QDTMT low-dose group. After the left anterior descending branch of coronary artery was occluded for 30 minutes followed by reperfusion for 2 hours， the whole blood was collected via right common carotid artery and the serum level of IL-10 was measured by ELISA. At the same time， HE staining was performed to detect the pathological change in myocardium， and the ultrastructural alterations of rats were observed with transmission electron microscope. Results The contents of IL-10 in serum were increased in QDTMT groups. Electron microscopic examination showed that pathologic changes of myocardiocytes in QDTMT groups were milder than those of the model group. The effects in QDTMT high-dose group were better than that in the low-dose group， and has insignificant difference with Diltiazem Hydrochloride group. Conclusion Qi-reinforcing and blood-activating prescription inhibits the inflammatory reaction by facilitating the expression of endogenous IL-10 and improving myocardial ultrastructural changes after myocardial ischemia/reperfusion in rats. These actions may contribute to its protective effect on the ischemic myocardial cells.
Key words：Qidan Tongmai Tablet；myocardial ischemia/reperfusion injury；inflammatory reaction；IL-10；myocardial ultrastructur；rat
既往研究已证实，芪丹通脉片对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用[1-2]。其作用机制可能是：通过增加缺血心肌对葡萄糖的摄取及利用，以改善缺血/再灌注的能量代谢障碍；有效地消除或抑制氧自由基的损伤；抑制心肌细胞线粒体中钙超载。而近年来的研究发现，炎症反应在缺血/再灌注损伤中起着重要作用。中医药可通过抑制炎症细胞的趋化及浸润、调节细胞因子的合成及分泌、下调炎症介质及粘附分子的表达等多种途径干预心肌缺血/再灌注后的炎症反应，发挥心肌保护作用。本实验旨在研究芪丹通脉片对缺血/再灌注损伤过程中炎症反应的影响，探讨其抗心肌缺血/再灌注损伤的作用是否与调节抗炎因子IL-10有关，从而进一步研究其心肌保护作用的机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性SD大鼠，体重220～250 g，中国人民解放军第四军医大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(军)2002-005。
1.2 仪器
RM-6280智能多道生理记录仪及分析处理软件，成都仪器厂；微型动物呼吸机，第二军医大学仪器厂；酶标检测仪，美国MR5000；JEM-2000EX透射电镜，日本日立。
1.3 试剂及药物
IL-10 ELISA试剂盒，美国Santa Cruz公司中国代理-北京中山生物技术有限公司提供。芪丹通脉片提取浸膏干粉由黄芪、丹参、红花各30 g，当归15 g，桂枝10 g组成，1 g干粉相当于原药材2.86 g，中国人民解放军第四军医大学西京医院制剂室提供，批号2002，ZL，068。恬尔心片，上海信谊万象药业股份有限公司产品，批号050601。
2 实验方法
2.1 动物模型的建立
2.1.1 大鼠心肌缺血/再灌注模型的制备
大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉后，固定，用针形电极分别插入右上肢和左右两下肢，记录标准肢体Ⅱ导联心电图。暴露气管，气管插管，分离右颈总动脉并插管，微型动物呼吸机给予正压人工呼吸，呼吸频率65～70次/min。按文献[3]方法在大鼠胸骨左缘2～3 mm，第2～4肋间做一纵行切口，结扎肋间动脉，打开胸腔，分离胸腺，暴露心脏，剪开心包。暴露左心耳，左心耳前角下缘2 mm处进针，经左冠状动脉下浅层于对侧室间隔出针，穿一5/0号丝线，以备结扎，稳定10 min后将一直径约0.2 cm聚氯乙烯胶管置于冠状动脉表面，拉线推管，使胶管压迫冠状动脉造成心肌缺血，用纹式钳固定，缺血30 min后放松结扎线使冠状动脉再通，再灌注2 h，其中假手术组不结扎。整个实验过程中，连续记录标准肢体Ⅱ导心电图。
2.1.2 实验动物模型成功标准
结扎后Ⅱ导心电图ST段明显上抬与高耸的T波融合，呈弓背向上单向曲线；肉眼观结扎线以下心肌颜色苍白为心肌缺血标志；松开结扎线后，以抬高的ST段下降1/2以上及左心室前壁紫绀消失者为灌注成功。
2.2 分组及给药
采用随机表法，将36只大鼠分为假手术组、模型组、恬尔心组及芪丹通脉片高、中、低剂量组，每组6只。根据大鼠体质量计算芪丹通脉片提取浸膏干粉高、中、低剂量组及恬尔心组给药量，即分别为芪丹通脉片提取浸膏干粉3.24、1.08、0.36 g/(kg·d)，恬尔心片5 mg/(kg·d)用蒸馏水配置成等体积混悬液，每只大鼠按10 mL/(kg·d)灌胃1次，假手术组和模型组以等体积蒸馏水灌胃，连续7 d后，第8天制备心肌缺血/再灌注模型。
2.3 观察指标与方法
2.3.1 病理形态学观察
实验结束后，在无菌条件下剪取左心室，4 ℃冰生理盐水冲洗干净，将标本入10%中性甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，切片厚3～5 μm；常规HE染色；在光镜下观察心肌组织病理形态学改变，包括心肌细胞均质样变性、炎性细胞浸润、心肌细胞坏死；电脑图像摄像。
2.3.2 心肌组织超微结构观察
实验完毕后，用锐利刀片取大鼠左心室结扎线下至心尖部中点内膜下的小块心肌，用4 ℃冰生理盐水洗去血迹。切成1 mm×1 mm×1 mm大小心肌组织，迅速置于4 ℃ 3%戊二醛-磷酸固定液中(pH 7.4)固定24 h，PBS缓冲液漂洗2×10 min。经1%锇酸固定2 h，50%、70%、90%、100%丙酮梯度脱水后置于丙酮与纯包埋剂(1∶1)中浸透30 min，再经纯包埋剂浸透过夜，包埋，65 ℃烘箱聚合，制备超薄切片，染色后在透射电镜下观察心肌超微结构。
2.3.3 ELISA检测血清白细胞介素-10含量
再灌注结束时，迅速从右颈总动脉取全血4 mL，静置30 min后，以3 000 r/min离心10 min，取上清液置于EP管-80 ℃保存，待实验结束后统一使用ELISA试剂盒，按说明书操作，测定血清IL-10水平。根据吸光值(OD)，应用CurveExpert1.38软件绘制标准曲线并计算对应的浓度。
2.4 统计学方法
实验数据以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件分析数据。多组样本均数进行方差齐性检验，组间比较采用方差分析；方差齐者，采用LSD检验；方差不齐者，采用Dunnet’s T3法。
3 结果
3.1 病理形态学观察
肉眼观察假手术组无心肌损伤及坏死；模型组与治疗组可见部分心肌损伤或坏死。显微镜下可见假手术组没有或仅有少量中性粒细胞渗出；模型组及治疗组心肌缺血区与坏死区可见大量中性粒细胞浸润；芪丹通脉片高、中、低剂量组和恬尔心组心肌损伤、坏死程度及中性粒细胞渗出程度均较模型组减少。
3.2 超微结构观察
模型组心肌超微结构破坏显著：心肌细胞坏死，肌纤维断裂、溶解，局灶性肌丝液化；线粒体成堆聚集、肿胀，局部膜破裂，基质密度降低，并出现浅亮区，呈空泡状，嵴断裂；细胞核肿胀，异染色质增多，细胞膜下可见大量炎性细胞浸润，间质水肿明显。芪丹通脉片高剂量组心肌超微结构破坏明显减轻：心肌细胞完整，排列整齐，肌丝、肌节排列较整齐，Z线清晰可见；线粒体轻度肿胀，包膜完整，形态规则，少有嵴降解；细胞核膜完整，染色质较均匀。
恬尔心组心肌超微结构破坏减轻：心肌细胞尚完整，肌丝、肌节排列尚整齐；线粒体增生，但肿胀轻微，嵴完整；细胞核稍肿胀，核膜完整，核染色质边聚。
3.3 缺血/再灌注后血清白细胞介素-10的变化
(见表1)表1 各组大鼠血清IL-10的变化(略)注：与假手术组比较，#P&<0.01；与模型组比较，▲P&<0.05，▲▲P&<0.01；与恬尔心组比较，★P&<0.01
4 讨论
心肌缺血/再灌注损伤是一种复杂的病理生理过程，主要表现为：①再灌注心律失常；②心肌顿抑；③心肌组织超微结构改变等[4]，其中心肌细胞超微结构的改变是反映细胞损伤最直观的指标[5]。本实验心肌超微结构显示，模型组的心肌组织肌原纤维排列紊乱，肌丝溶解液化；线粒体增生、肿大，有较多空泡形成，部分嵴出现断裂溶解现象；细胞核固缩，核膜模糊，部分出现破裂；核膜下可见大量炎性细胞浸润，说明缺血/再灌注后心肌损伤坏死较为严重且有炎症反应的发生。芪丹通脉片高剂量组和恬尔心组心肌纤维排列较整齐，Z线清晰可见；线粒体结构完整，虽可见轻度肿胀，但包膜完整，形态规则，少有嵴断裂，无空泡样变性；核膜完整，无细胞核固缩、变形及炎症细胞浸润等现象，与模型组相比有明显差异。提示高剂量芪丹通脉片和恬尔心可改善心肌线粒体超微结构，减少炎症细胞的浸润，保护缺血/再灌注损伤心肌，且二者无显著性差异。
近年来研究表明，炎症反应贯穿于心肌缺血/再灌注损伤的全过程，细胞因子在其中发挥重要作用[6]。心肌缺血/再灌注损伤是一个包括中性粒细胞活化，多种细胞因子及粘附分子过度表达，伴有多种炎性介质及信号转导分子参加的复杂操作过程。其中促炎因子IL-10是心肌缺血/再灌注早期就已产生的一种抗炎介质。
IL-10是一种多功能、多细胞源性的炎症抑制因子，在下调炎症反应中发挥关键作用[7]，是目前备受关注的抗炎介质之一。本实验结果表明，芪丹通脉片高、中、低剂量组和恬尔心组血清IL-10较模型组均有不同程度升高，其中以高剂量组和恬尔心组的作用最为显著，且二者无显著性差异。
在心肌缺血/再灌注损伤的过程中，心肌缺血是基本病因。由于较长时期心肌缺血、缺氧，直接导致心肌失养而存在着不同程度的心气亏虚。缺血期间局部心肌血脉流行不畅，血液不能正常循行；再灌注后，因心气亏虚，运血无力，终致血行瘀阻。因此，气虚血瘀是心肌缺血/再灌注的基本病理变化之一[8]。现代药理研究表明，丹参对心肌缺血/再灌注发生发展过程中白细胞趋化、激活、粘附、聚集等血液流变性都有很强的作用，打破了由白细胞引发的“恶性循环”[9]；当归不仅具有钙通道阻滞作用以抑制钙超载，同时能改善心肌超微结构以消除炎症反应，达到保护心肌的作用[10]；黄芪亦具有稳定心肌细胞膜和线粒体结构的功能，保护心肌细胞和内皮细胞以发挥保护缺血/再灌注心肌损伤的作用[11]；红花已分离鉴定出60多种化学成分，其中有许多成分都具有抗炎作用。益气活血复方芪丹通脉片由黄芪、丹参、当归、红花、桂枝组成，广泛用于治疗缺血性心脏病。本实验发现：大鼠心肌缺血/再灌注后血清IL-10含量减少，心肌组织有大量炎症细胞浸润，心肌纤维结构紊乱；芪丹通脉片组可促进内源性IL-10大量释放，减少炎症细胞浸润从而减轻炎症反应，保护缺血/再灌注心肌；该保护作用呈剂量依赖性，即随着药物剂量的增加，其心肌保护作用亦随之增强，且高剂量组的保护作用与恬尔心组无显著性差异。由此，我们认为益气活血复方芪丹通脉片对缺血/再灌注的保护作用可能与促进内源性IL-10的释放，从而抑制或减少炎症级联反应对缺血/再灌注心肌的损伤有关。
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