作者：董晞，赵世萍，刘岩，李平
【摘要】 目的 观察人参皂苷Rb1和Re对乌头碱导致的心肌细胞损伤的影响。方法 选用乳鼠心肌细胞，观察人参皂苷Rb1和Re分别与乌头碱配伍使用后，乳鼠心肌细胞上清心肌酶谱的改变，采用RT-PCR的方法，观察人参皂苷Rb1和Re与乌头碱配伍对心肌细胞钙离子通道基因Cav1.2 mRNA的影响。结果 人参皂苷Rb1和Re可以有效对抗由乌头碱导致的心肌酶谱改变。同时，可以对抗乌头碱所致的钙离子通道基因Cav1.2 mRNA表达上调。结论 人参皂苷Rb1和Re与乌头碱配伍具有减毒增效的作用，这可能与人参皂苷减轻了乌头碱所致的心肌细胞损伤和改善钙离子通道异常表达有关。
【关键词】 人参皂苷Rb1；人参皂苷Re；乌头碱；心肌酶谱；钙离子通道
Abstract：Objective To investigate the protective effect of ginsenoside Rb1 and Re on injury of the neonate rat cardiomyocyte induced by aconitine alkaloids. Methods The influence of aconitine and ginsenoside Rb1， Re together in neonate rat cardiomyocyte was observed respectively. The influence of these components in neonate rat cardiomyocyte was examined by myocard zymogram. The expression of Ca2+ channel gene Cav1.2 mRNA of neonate rat cardiomyocyte after treatment was observed by RT-PCR. Results The ginsenoside Rb1 and Re were able to decrease the release of AST and LDH， reverse Cav1.2 mRNA abundance induced by aconitine. Conclusion The ginsenoside Rb1 and Re which together with aconitine can alleviate the side effects and boost up the therapeutic effects of aconitine. The action mechanism may be relation with that the ginsenoside Rb1 and Re can decrease injuries of the neonate rat cardiomyocytes and abundant expression of Cav1.2 mRNA induced by aconitine.
Key words：aconitine alkaloids；ginsenoside Rb1；ginsenoside Re；myocard zymogram；Ca2+ channel
为了探讨人参与乌头碱的相互配伍作用，了解人参各成分与乌头碱之间是否有配伍减毒的作用，笔者采用了人参皂苷Rb1和Re分别与乌头碱共同作用于乳鼠心肌细胞，观察它们对于心肌细胞心肌酶谱变化是否存在相互作用，并观察了这两种人参皂苷对于乌头碱导致的心肌细胞膜钙离子通道基因Cav1.2mRNA表达的影响。
1 实验材料
1.1 动物
出生后1～3 d的Wistar大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2002-0002。
1.2 试剂和仪器
乌头碱(AC)、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re(中国药品生物制品检定所产品，批号分别为110720-200410、110704- 200318、754-200115)，DMEM高糖(GIBCO公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)，胎牛血清(北京市元亨圣玛生化制品有限公司)，5-溴脱氧尿苷(Sigma公司)，培养瓶(COSTOR公司)，24孔培养板(NUNC公司)。SABC免疫细胞化学试剂盒、Mouse Anti-saconmericactin抗体、DAB染料(武汉博士德生物公司)。Trizol-100试剂盒(GIBICO，lnvitrogen Corporation生产)，逆转录(RT)试剂盒、PCR试剂盒均为promega公司产品，购自北京华美转导科技有限公司。倒置显微镜(奥林帕斯公司，日本)，恒温CO2培养箱(NAPCO，美国)，全自动生化检测仪(日立7600)，高速冷冻离心机(久保田3740，日本)，Bio-RAD电泳仪、ABI PCR仪、Alphalmeager凝胶成像系统(Alpha Inotech公司)，全波长紫外/可见光扫描分光光度计(NanoDrop ND-1000)。
2 实验方法
2.1 乳鼠心肌细胞培养
参照文献[1]方法稍加改进，进行乳鼠的原代心肌细胞培养及传代。取出生后1～3 d的Wistar乳鼠，在无菌条件下开胸取出心脏，置于无Ca2+、Mg2+的Hank’s液中，清洗4次，去除心房及残留的血液，移入无菌小瓶中，用眼科剪刀将心室剪成1 mm3的组织碎块，加入0.1%胰蛋白酶消化，8 min后沉淀心肌组织，弃去首次消化的细胞悬液。再次加入0.1%胰蛋白酶消化8 min，吸取细胞悬液移入另一装有少量20% FCS/DMEM培养基的离心管中终止消化，1 200 r/min离心10 min，弃上清液，加入完全培养液，悬起细胞。此步骤重复6～8次，直至组织块消失。合并所有细胞悬液，100目筛网过滤后，再次离心收集细胞。用含有20%胎牛血清的DMEM将细胞悬起，转入25 cm2培养瓶中，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养2 h，以差速贴壁的方法去除非心肌细胞，加入含有5-溴脱氧尿苷(0.1 mmol/L)的完全培养基稀释细胞悬液，平均分入若干培养瓶后继续培养，36 h后换液。倒置显微镜观察细胞生长状况及细胞博动情况，待细胞长满后，用浓度为0.125%胰蛋白酶和0.02% EDTA-Na2的消化液进行消化传代，以试验所需密度传入24孔板中，继续培养24 h左右，即可用于试验。
2.2 心肌细胞的鉴定
将分离的心肌细胞接种于6孔细胞培养板，培养48 h后用4%多聚甲醛固定，采用鼠抗α-sacomeric actin antibody及SABC免疫组化染色试剂盒对心肌细胞中特有的横纹肌肌动蛋白进行定位，对心肌细胞鉴定，同时确定心肌细胞纯度。
2.3 人参皂苷Rb1和Re对由乌头碱导致的心肌细胞损伤的保护作用
将原代培养的心肌细胞按5×104 cells/孔的密度传代至24孔板中，培养12 h，更换成含有2% FCS的DMEM培养液。继续培养12 h后，分为4组加药：不加药物空白细胞对照组空白组、0.3 mmol/L乌头碱单独作用组、0.1 mmol/L人参皂苷Rb1和0.3 mmol/L乌头碱共同作用组、0.1 mmol/L人参皂苷Re和0.3 mmol/L乌头碱共同作用组。作用24 h后取上清液，全自动生化检测仪检测心肌酶谱的变化。
转贴于 2.4 人参皂苷Rb1和Re对由乌头碱导致的心肌细胞钙离子通道基因Cav1.2 mRNA表达上调的影响
将原代培养的细胞按2×108 cells/L密度传代至6孔板中，培养24 h后，分为4组进行加药：不加药物空白细胞对照组、0.1 mmol/L乌头碱单独作用组、0.1 mmol/L乌头碱组与0.1 mmol/L人参皂苷Rb1共同作用组、0.1 mmol/L乌头碱与0.1 mmol/L人参皂苷Re共同作用组。作用8 h后，用PBS冲洗3次，用TRizol一步法提取心肌细胞的总RNA：每5×105cells加Trizol 0.8 mL，吹打均匀；加0.16 mL氯仿摇匀，12 000 r/min离心15 min；上清移至新管，加0.4 mL异丙醇，12 000 r/min离心10 min；弃上清，加75%乙醇1 mL，清洗，离心7 min(10 000 g)。DEPC·h3O溶解RNA。1%琼脂糖凝胶电泳观察18 s与28 s条带密度比值约等于2，确保RNA的纯度和完整性。将RNA进行琼脂糖凝胶电泳，并检测其纯度及浓度。各总RNA样本OD260/OD280的比值均为1.8～2.0。取1.5 μg上述总RNA产物，用promega逆转录酶，按照产品说明书操作，总反应体系为25 μL。
引物序列与合成：Cavl.2，GAPDH序列，上海生工生物工程有限公司合成。
Cav1.2引物序列：上游引物序列5’-GTCATCATCATC TATGCCATT-3；下游引物序列5’-GCG-GCTGAACTTGGATT-3。扩增片段长度680 bp。
GAPDH引物序列：上游引物序列5’-ACGGCAAATTCAA CGGCACAGTCA-3，下游引物序列5’-CTGGGGGCATCGGCAGAAGG-3。扩增片段长度251 bp。
PCR反应体系：2 μL cDNA， 0.3 μL promega Taq，25 mmol/L MgC12 1.2 μL，上下游引物各0.8 μL。2 μL 10×PCR Buffer。加入DEPC·h3O至20 μL。
GAPDH扩增条件：预变性94 ℃， 2 min； 94 ℃，20 s， 58 ℃， 30 s，72 ℃，45 s；终末延伸72 ℃， 10 min。30 cycles。
Cav1.2扩增条件：预变性95 ℃，2 min；95 ℃，30 s，55 ℃， 45 s，72 ℃，45 s；终末延伸72 ℃， 10 min。35 cycles。
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，照相并进行半定量分析。基因的表达水平以Cav1.2与GAPDH的光密度比值来推断。每组PCR反应至少重复3次以获得平均值。
2.5 统计学方法
所有数据均采用SPSS 11.0统计软件处理，数据用x±s表示。
3 结果
3.1 心肌细胞培养的形态学观察
分离出来的心肌细胞孵育36 h后更换培养液，倒置显微镜下即可观察贴壁心肌细胞的生长状况。心肌细胞贴壁后逐渐展开，形态多样，从圆形到梭形、三角形、星形、多角形，并可以见到单个细胞搏动，频率较快，40～80次/min。换液后24 h，多个临近的细胞伸出伪足交联形成细胞簇，单个细胞搏动转变为细胞簇搏动，最后多个细胞簇同步搏动，频率80～130次/min。这时的细胞即可用于实验。
3.2 心肌细胞的鉴定
采用分离培养后的Wistar乳鼠心肌细胞，培养3 d后，根据心肌细胞中所含有的各种蛋白特性，我们将其特有的横纹肌肌动蛋白(Mouse Anti-saconmeric actin)作为检测鉴定指标，采用免疫细胞化学法对所培养的心肌细胞进行鉴定。根据检测结果，在培养的细胞中，凡被DAB染上棕黄色的细胞，均为心肌细胞，随即对5个显微镜视野中细胞总数和心肌细胞数量进行计算，心肌细胞纯度达到90%左右。
3.3 人参皂苷Rb1和Re对乌头碱导致的心肌细胞损伤的作用
3.3.1 人参皂苷Rb1和Re与乌头碱共同作用对培养大鼠心肌细胞心肌酶谱变化的影响
(见表1)表1 人参皂苷Rb1和Re对乌头碱诱导的乳鼠心肌细胞心肌酶谱变化的影响(略)注：与乌头碱组比较，*P&<0.05，**P&<0.01。
3.3.2 人参皂苷Rb1和Re与乌头碱共同作用对心肌细胞钙离子通道基因Cav1.2 mRNA表达的影响
以大鼠心肌细胞总RNA为模板，以特异性引物扩增Cav1.2和GAPDH的特异片段，在1%琼脂糖凝胶电泳后可见在680 bp处及251 bp处出现条带，与预期的目的条带位置相符。cDNA电泳紫外扫描分析结果见图1。
4 讨论
近年来，中药复方相互配伍减毒增效受到越来越多研究者的关注。乌头碱具有明显的毒性作用，其主要的毒性靶器官是心脏，它的毒性机制是抑制心肌三羧酸循环和呼吸链的氧化磷酸化作用，并引起细胞膜离子通道的改变，使心肌有氧代谢障碍，心肌供能不足，导致心肌细胞凋亡和坏死[2-3]。人参皂苷为人参的有效成分，生物活性广泛。多年的研究发现，它们具有抗衰老、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤以及调节中枢神经系统等多种药理作用。多年的临床工作已经证实，乌头和人参相互配伍有很好的减毒功效，但是目前尚未见到有关人参中的活性成分与乌头碱配伍对于心肌细胞作用的研究报道，因此，我们从心肌酶谱、钙离子通道基因Cav1.2 mRNA表达等方面观察了人参中两种单体成分对乌头碱导致心肌细胞损伤的保护作用。
天门冬氨酸转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)以及肌酸激酶的同功酶mb(CK-mb)等主要存在于心肌中，一般称为心肌酶类。在心肌细胞膜受到损伤后，心肌细胞内的这些酶类就会漏出到培养介质中，因此，测定培养介质中这些酶类的的活力可反映细胞膜受损的情况。Tanz等[4]曾报道了乌头碱可使心肌细胞漏出大量的LDH，梁氏等[5]在光镜下也曾观察到乌头碱中毒大鼠心肌细胞LDH活性增强。本实验将乌头碱作用于心肌细胞后，细胞上清中AST、LDH、CK、CK-mb的含量均有显著上升，说明乌头碱对心肌细胞膜有较大的损伤作用；在与人参皂苷Rb1、Re共同作用于心肌细胞时，细胞培养上清中AST、LDH的漏出有所减少，而对CK，CK-mb的作用则不明显。说明人参皂苷Rb1、Re对乳鼠心肌细胞膜有一定程度的稳定作用。
心肌细胞内的钙离子稳态对保持细胞的正常生理功能是非常重要的，杨氏等[3]研究提示，钙通道在心律失常的发生、发展中极其重要。Cavl.2基因是ICa-L成分的基因，本实验结果显示，乌头碱能够促进Cavl.2 mRNA表达，引起ICa-L电流密度增加，细胞内Ca2+浓度增高，这可能是乌头碱诱发整体动物心肌损害的离子基础。本实验证实，人参皂苷Rb1、Re可对抗乌头碱所致的Cav1.2 mRNA表达上调，从而降低心肌细胞内钙浓度，减轻钙超载所造成的心肌细胞功能异常。
在以上实验的两个方面，人参皂苷Rb1均表现出较强的作用，这与郭氏[6]曾报道过的人参皂苷Rb1对肥厚乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤有很好的保护作用相吻合；人参皂苷Re在对心肌酶谱改变方面的作用强度与Rb1类似，但对抗乌头碱导致钙离子通道基因Cav1.2 mRNA表达上调的作用较弱。
由以上实验可以看出，乌头碱对心脏的毒性作用机理可能是多方面的，剂量较小时(0.1 mmol/L)导致膜上钙离子通道基因Cav1.2 mRNA表达上调，使细胞内Ca2+浓度增高，造成钙超载状态，致使心肌细胞功能异常；而剂量较大时(0.3 mmol/L)则可能使细胞膜结构上的酶活性发生改变，细胞膜的完整性受到破坏，细胞的整体功能受到伤害，导致细胞坏死。而人参皂苷Rb1和Re的作用，则在乌头碱剂量较小时，可反向调节被乌头碱升高的Cav1.2 mRNA表达，起到拮抗作用，在乌头碱剂量较大时，人参皂苷Rb1和Re对被乌头碱破坏的细胞膜有一定的稳定作用。
【参考文献】
[1] 沈 静，谢苗荣，徐 雍，等.乳鼠心肌细胞培养及纯化方法的改良[J].中国医药导刊，2001，3(3)：225－226.
[2] 雷怀诚，宋道江，易建华，等.大鼠乌头碱中毒心肌细胞凋亡的研究[J].中国工业医学杂志，2004，17(6)：373－374.
[3] 杨宝峰，单宏丽，龚冬梅，等.抗心律失常药物作用最佳靶点研究[J].哈尔滨商业大学学报，2002，18(1)：1－5.
[4] Tanz R，Opie L.Effect of drug or electrically induced tachyarrhythmias on isolated perfused guinea pig heart. 1.Comparison of the effects produced by ouabain， calcium， epinephrine and aconitine[J].J Pharmacol Exp Ther，1978，206(2)：320－330.
[5] 梁强荣，刘明俊，胡炳蔚.大鼠乌头碱中毒心肌酶的研究(Ⅳ)[J].中国法医学杂志，1991，6(3)：140－141.
[6] 郭 佳，刘小康，武 文，等.人参皂苷Rb1预适应对肥厚乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学，2005，10(9)：1010－1014.