作者：王哲，太史春，赵金茹，李淑玲，王德山
【摘要】 目的 观察肺气虚模型大鼠肺、肾组织水通道蛋白1(AQP1)表达及血浆中内皮素(ET)水平的变化，为中医学肺肾相关理论提供实验依据。方法 20只大鼠随机分为模型组和对照组，应用放射免疫方法测定血中ET含量；应用Western blot方法测定AQP1蛋白含量的变化。结果 肺气虚模型组肾组织AQP1表达高于对照组，而肺组织AQP1表达低于对照组；模型组血浆ET明显升高，与对照组比较，差异有显著性(P&<0.05)。结论 肺气虚模型大鼠肾组织AQP1表达增强，而肺组织AQP1表达降低，ET可能促进肾组织AQP1表达、抑制肺组织AQP1表达。
【关键词】 肺气虚；水通道蛋白1；内皮素；动物模型
Abstract：Objective To observe the changes of lung and kidney aquaporin-1 expression in Lung-Qi deficiency model rats and to investigate and compare the effects of endothlin (ET) on the expression of lung and kidney aquaporin-1. It provide expremental basis to the theory of mutual relationship of lung and kidney. Method Twenty healthy rats were pided into the model group and the control group. Sample blood was taken and ET was measured by radioimmunoassay. The method of Western blot was used to observe the expression of aquaporin-1 in lung and kidney. Result The expression of aquaporin-1 in kidney was higher in model group than in the control group， while the expression of aquaporin-1 in lung was on the contrary. Compared with the control group， ET in the plasma was higher in the model group (P&<0.05). Conclusion The expression of aquaporin-1 in kidney， was higher in Lung-Qi deficiency model rats and ET promotes the expression of aquaporin-1 in kidney， but on the contrary in lung.
Key words：Lung-Qi deficiency；aquaporin-1；endothlin；animal model
水通道蛋白(AQPs)是多种组织细胞膜上存在的转运水的特异性孔道。目前对水通道的研究还仅限于其生理作用及调节机制方面，关于肺气虚模型大鼠肺、肾组织水通道蛋白(AQP1)的变化及两者之间的关系尚无报道。笔者利用分子生物学手段研究了肺气虚模型大鼠肺、肾组织AQP1表达的变化。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
健康Wistar大鼠20只，辽宁中医药大学实验动物中心提供，雌雄不拘，体重为(225±25)g。随机分为对照组和模型组，每组10只。
1.2 主要试剂及药物
脂多糖(LPS)由美国Sigma公司提供，AQP1抗体由武汉博士德公司提供，内皮素(ET)放射免疫试剂盒由北京北方生物技术研究所提供。
1.3 造模
模型组：
参考文献
[1]方法建立肺气虚证模型。于模型制作的第1、14天用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，切开颈部皮肤，分离肌肉，暴露气管，用1 mL注射器气管内注入LPS 200 μg/200 μL，在皮肤伤口局部滴入庆大霉素注射液，然后缝合皮肤并用碘伏消毒。第2～13天、15～28天，置于1 m3的烟室中，点燃力士牌香烟(焦油量为15 mg，烟气烟碱量为1.3 mg)熏，每日烟熏30 min，自由进食、饮水。对照组：将每只大鼠于第1、14天用10%水合氯醛腹腔麻醉后暴露气管，用1 mL注射器气管内注入0.9%氯化钠注射液200 μL，在皮肤伤口局部滴入庆大霉素注射液，然后缝合皮肤并用碘伏无菌操作，第2～13天、15～28天，置于无烟熏同样环境中饲养，自由进食、饮水。
1.4 检测方法
动物造模28 d后，用10%水合氯醛麻醉，从大鼠腹主动脉取血5 mL，混匀，采用放射免疫分析技术，测定血浆中ET的含量，在中国医科大学核医学室完成。取肺、肾组织，采用Western blot方法检测AQP1：组织以1∶5比例加入裂解缓冲液，匀浆机匀浆，4 ℃、12 000 r/min离心1 h，上清为膜蛋白。采用酚试剂法进行样品(蛋白)浓度的定量，把样品调成相同浓度，加入buffer，沸水煮5 min，上样、电泳、转印、加抗体孵育、染色，然后扫描成图。
1.5 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件分析，实验数据均采用x±s表示，组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 肺气虚造模对大鼠行为及体征的影响
经过2个月造模饲养，模型组大鼠先后出现咳嗽、气急、喘鸣、精神萎靡、行动迟缓、蜷伏不动、消瘦便溏、毛发卷曲、舌色发青等体征；对照组则无异常改变。
2.2 肺气虚造模对大鼠血浆中ET水平的影响
(见表1)表1 肺气虚模型对大鼠血浆中ET水平的影响(略)注：与对照组比较，*P&<0.05。
2.3 肺气虚造模对大鼠肾、肺组织AQP1蛋白Western blot印迹的影响
取肺脏左下叶、肾脏皮髓交界处组织进行蛋白测定，前3条泳道为对照组，后3条泳道为肺气虚模型组，结果显示，肺气虚模型组肾组织AQP1表达高于对照组，而肺组织AQP1表达低于对照组。见图1。
3 讨论
AQP1在肺内主要分布于肺泡周围血管内皮，其表达量虽然不大，但对于维持血管与间质之间的水运动平衡意义重大。Towne等[2]使小鼠感染某种呼吸道腺病毒造成病毒性肺炎，肺水肿明显增加，在病毒感染后7 d和l4 d分别检测AQP1和AQP5，发现两者表达量均有显著降低，提示AQPs的减少可能是水肿液在肺间质聚集的重要原因，表明AQPs可能在病毒感染后的肺水肿中起主要作用。肺气虚时肺微血管内皮细胞AQP1表达减少，水转运功能下降，可能影响对肺间质水肿液转运，参与了肺水肿的发病机制。而本实验利用Western杂交技术证明肺气虚模型大鼠肺脏AQP1蛋白表达减少。AQP1定位于近曲小管上皮细胞的刷状缘及其侧部的内折处，刷状缘上大量AQP1有利于水的重吸收。而AQP1在内折处的存在表明水可能由此进入细胞间隙或管周间隙。在近曲小管上皮细胞表达的AQP1一直延续至髓袢降支细段，而在升支细段则无表达，这可能与两部分水的不同渗透性有关。另外，AQP1也分布于髓质内与髓袢伴行的血管内皮中。AQP1在肾脏的这种分布以及对水通透的特异性在分子水平上很好地解释了水的重吸收过程，并为水跨膜转运理论提供了依据。AQP1表达增高，有利于该部位对水的重吸收，尿液生成可以减少，疾病状态下可以导致液体在体内潴留。本实验结果显示，肺气虚模型大鼠肺脏AQP1表达减少，肾脏AQP1表达增加，说明在病理状态下，肺失宣降，通调水道失职，累及于肾，为肺肾相关理论提供了一个较好的证明。
ET是引起血管强烈收缩的活性多肽物质，由内皮细胞合成分泌，肺不仅是富含ET的器官，还是ET清除和代谢的主要器官。缺血、低氧和高碳酸血症，均可刺激ET的释放。为此，不难推测，ET同样与中医肺气虚证的病理生理改变之间存在着一定的联系。本实验结果表明，模型组与对照组比较，血浆中ET含量明显升高(P&<0.01)。提示ET具有对AQPs调控的可能。本实验结果表明，模型组在肺气虚时ET含量明显升高的同时肾脏AQP1蛋白表达增加，其机制可能是通过这一途径来调节肾脏AQP1蛋白的表达。
【参考文献
】
[1] 李泽庚，彭 波，张杰根，等.肺气虚证模型大鼠的建立[J].北京中医， 2005，24(1)：53－55.
[2] Towne JE，Harrod KS，Krane CM，et a1.Decreased expression of AQP1 and AQP5 in inolLse after acute viral infection[J].Am J Respir CeU Mol Biol，2000，22：34－44.