关于尿液蛋白质定量测定方法及临床意义

【摘要】 正常人尿液中含有微量的蛋白质，每天排出量在150mg 以下，其中以白蛋白占多数，随不同病种有一定量的球蛋白和其它蛋白。随着肾病科研工作的开展，以观察患者每天排出蛋白质的量以示病情的变化，因此尿液蛋白质定量在临床上有实际应用价值，已成为医院化验室常规的检验项目。
　　【关键词】 尿液 蛋白质 检测
　　1 丽春红-S法
尿液标本中的蛋白质与丽春红-S染料混匀后一起被三氯醋酸沉淀，将沉淀物溶解于碱性溶液中，此时溶液呈紫色，显色深度与蛋白质浓度成正比。
　　1.1试剂　　
　　三氯乙酸-丽春红-S试剂原液：称取丽春红-S 1.0 g，加入到1 000 ml 300 g／L三氯乙酸中溶解。
　　三氯乙酸-丽春红-S试剂应用液：将原液用蒸馏水按1：10稀释，放置室温稳定数月。
　　蛋白定性试剂。0.2 mol／L氢氧化钠溶液。
　　蛋白标准曲线：把定值蛋白稀释成不同的浓度，按操作测定其吸光度，以吸光度为横坐标，以稀释后的蛋白浓度为纵坐标绘制标准曲线。
　　1.2操作 先做尿蛋白定性试验，以适当稀释标本。在试管中加入100μl标本，再加入1 ml三氯乙酸一丽春红-S应用液，混匀后以3 000 r／min离心15分钟，吸去上清液，倒置于洁净滤纸上。在沉淀中加入0．2 mol／L氢氧化钠溶液l ml，用560 nm波长测定其吸光度，查标准曲线的蛋白含量。
　　1.3参考值 46.5±18．1 mg／L
　　1.4注意事项 ： 尿液如被稀释应乘以稀释倍数。尿中血红蛋白含量&>5 mg／L时影响结果。离心后上清必须全部弃去，若沉淀中夹带有丽春红-S影响比色结果。
　　2 双缩脲比色法　　
　　以磷钨酸乙醇溶液沉淀尿中的蛋白质，在碱性介质中蛋白质与铜离子形成紫红色络合物，与标准液比色即可得出尿中蛋白质的含量。
　　2.1试剂　　
　　蛋白沉淀液：称取磷钨酸7.5 g，加入30 ml蒸馏水、95％乙醇385 ml、浓盐酸25 ml。
　　双缩脲液：(1)称取枸橼酸钠34．6 g，无水碳酸钠20 g，加入120 ml蒸馏水使其溶解；(2)称取硫酸铜3．46 g，加入20 ml蒸馏水使其溶解。将(1)、(2)混合，加入蒸馏水至200 ml，备用。0．75 mol／L氢氧化钠溶液。蛋白标准液(1．5 g／L)：称取150 mg结晶型冻干人血清白蛋白，加入100 ml的3 g／L苯甲酸溶液溶解。
　　2.2操作 取5 ml 24小时混合尿液，2 500～3 000 r／min离心5分钟，取上清备检。混匀放入56℃水浴15分钟，取出后离心，倾上清留沉淀。0．75 mol／1
　　NaOH　　 1．5　　 1．5　　 1．5　　
　　双缩脲液 0．1 　　　 0．1 　 0．1　　
　　各管混匀置室温10分钟，在540 nm波长，以空白管调“0”比色。
　　2.3结果计算 尿蛋白含量(g／L)=测定管吸光度÷标准管吸光度×1．5
　　2.4参考值 &<150 mg／24 h尿、
　　2.5注意事项 ： 记录24小时尿量，将尿液混合后再离心。先做尿标本蛋白定性试验，若为阳性再做本试验。尿蛋白浓度较高时应稀释标本再操作。若疑有药物干扰时，可将尿蛋白沉淀物用无水乙醇洗涤3次再操作。
　　3 考马斯亮蓝法　　
　　在酸性介质中考马斯亮蓝与尿液中的蛋白质NH3+基团结合，发生由棕色到蓝色的颜色变化，光谱吸收峰由465 nm移至595 nm。与标准液相比即可测出尿蛋白质含量。
　　3.1试剂　　
　　考马斯亮蓝溶液：(1)称取75 mg考马斯亮蓝G-250溶于40 ml甲醇中；(2)加入蒸馏水800 ml、85％的浓硫酸100 ml、浓盐酸5 ml；(3)称取30 mg十二烷基磺酸钠，溶于(2)中；(4)加蒸馏水至1 000 ml，用滤纸过滤至棕色瓶中，室温保存。
蛋白标准液(1g/L) 以3g/L苯甲酸溶液稀释蛋白质标准。
　　3.2操作　　
　　留取24小时尿标本混匀，取5 ml尿液离心后取上清备检。室温放置5分钟，以空白管调“0”，波长600 nm读取光密度。
　　3.3结果计算　　
　　尿蛋白质含量(g／L)=测定管吸光度÷标准管吸光度×1．0
　　3.4参考值 (20．6～172．6)mg／24 h
　　3.5注意事项 ：考马斯亮蓝溶液要定期新鲜配制，过滤后才可使用。测定标本时应同时测定蛋白质标准管。尿中的水杨酸类药物、麝香草酚和去污剂等可产生颜色干扰。尿标本蛋白质定性试验在(+++)以上需稀释后测定。 　　4 微量蛋白检验
　　尿液微量蛋白包括纤维蛋白降解产物、尿α1微球蛋白、尿α2微球蛋白、微量白蛋白等。
　　4.1 纤维蛋白降解产物(fibrinogen degradation products， FDP) FDP是纤维蛋白(原)经纤溶酶作用降解的产物。其检测现多用免疫学方法：免疫胶乳凝集法和ELISA法。正常人尿液无FDP。当肾脏及尿路局部炎症时，其渗出的少量纤维蛋白经纤维蛋白溶解酶降解，产生FDP。当肾小球病变至肾小球滤过膜通透性增高时，FDP碎片排于尿中。血液FDP增高时，尿液FDP排泄也增多。
　　4.2 α1-微球蛋白 α1-微球蛋白(α1-microglobulin，α1-M)是一种小分子量糖蛋白，由肝脏与淋巴细胞合成，广泛存在于体液及淋巴细胞膜表面。血液中存在两种形式的α1-M，一种为游离形式，另一种为与IgA结合形式。前者易被肾小球滤过，几乎全部被肾小管重吸收和代谢。检测方法多采用放射免疫法和ELISA法。
　　临床意义 ：单纯尿α1-M增加见于早期肾小管损害。血与尿中α1-M均增高多见于肾小管与肾小球功能障碍如慢性肾功能衰竭。尿中出现结合型α1-M提示肾小球滤过膜受损。
　　4.3 β2-微球蛋白 β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-M)是一种小分子量单链多肽，是人类白细胞抗原I类抗原的轻链，经肾小球完全滤过，由肾近曲小管以胞饮方式摄取并降解为氨基酸，不返流入血液。
　　检测方法多采用放射免疫法和ELISA法，正常人尿液β2-M含量少(&<0.2 mg／L)。
　　临床意义 ： 当肾小球滤过率下降或肾近曲小管损害时，血中β2-M增高；超过正常3倍时，尿中β2-M也增高。
　　4.4 微量白蛋白 微量白蛋白(microalbumin，M-alb)尿是肾病的早期征兆，是反映肾小球毛细血管壁通透性的指标。检测方法多采用放射免疫法和ELISA法。当尿液白蛋白浓度在30～300 mg／24 h(或20～200 mg／L)时，用常规方法检测尿液蛋白仍为阴性。
　　临床意义：当尿常规试条检测蛋白为阳性时，此时白蛋白浓度已大于200 mg／L，称为大量白蛋白尿。早期检测M-alb是监测肾脏病变的有效方法，尤其对糖尿病肾病的早期诊断具有重要价值。当白蛋白&>300 mg/24 h时，糖尿病肾病的预后较差。另外，对于高血压患者，可以预示高血压病的发病率及死亡率。
　　5 尿蛋白测定的临床意义
　　正常人终尿中的蛋白质含量很少，仅为30～130 mg／24 h。随机一次尿中蛋白质为0．80 mg／L。当尿液中蛋白质超过正常范围时称为蛋白尿。
参 考 文 献
[1]戴慧莉， 钱家麒， 严玉澄. 低分子量尿蛋白在原发性肾小球肾炎中的作用. 上海第二医科大学学报， 2003 ，23 (5) : 4232426.
[2]沈霞. 电泳技术的现状和发展. 中华检验医学杂志， 2001，24 (5) :2632265.
[3]赵绍林， 吴惠毅， 杨新玲， 等. 超薄琼脂糖凝胶的简易制备技术.临床检验杂志， 2004 ，22 (4) : 251.
[4]沈霞， 张敏华， 汪萍， 等. 非浓缩尿蛋白电泳的临床应用. 中华检验医学杂志， 2001 ，24 (5) : 266～268.