Psammaplin A对人结肠肠癌LS174-T细胞增殖和凋亡影响的分析

论文网： 　　　　　　 作者：孟庆凯 张菁茹 吴佳阳

【摘要】 目的 探讨作用人结肠癌LS174-T细胞后，PTEN与p-Akt信号通路中，VEGF、MMP-9表达差异并探讨其相互关系。方法 应用体外细胞培养技术，采用MTT实验测定Psammaplin A对LS174-T细胞增殖的影响；用流式细胞仪分析细胞周期；通过免疫印记法检测Psammaplin A对LS174-T细胞中凋亡相关基因PTEN和p-Akt的影响；采用ELISA法检测Psammaplin A干预前后LS174-T细胞的VEGF、MMP-9蛋白分泌水平的变化。结论 Psammaplin A能够抑制大肠癌LS174-T细胞的增殖，并且促进其凋亡，其机制可能与上调PTEN的表达和抑制Akt的磷酸化有关，并通过调控VEGF、MMP-9的分泌实现LS174-T的增殖抑制及凋亡。
【关键词】 Psammaplin A LS174-T细胞 增殖和凋亡 PTEN p-Akt
　　Psammaplin A是从海洋海绵体生物中发现和得到的一类酚类化合物，对多种肿瘤细胞具有细胞毒性作用，是一种崭新的有望突破的抗肿瘤治疗药物。最新研究指出其能够通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡两种途径来抑制细胞增殖[1]。PTEN基因(也称MMAC1或TEP1基因)是迄今发现的第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因，它在细胞内信号传导通路的调控中起关键作用，不但参与正常细胞生长、发育的调控，而且在抑制肿瘤发生、发展及转移中起重要作用。AKt是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，处于PI3K/Akt信号转导通路的核心部位[2]。研究表明AKT的过表达和活化与肿瘤的发生密切相关。Psammaplin A抑制结肠癌细胞增殖及诱导凋亡中PTEN和p-Akt在信号转导途径所起的作用相关报道较少。本研究通过体外人结肠癌细胞株LS174-T培养，观察Psammaplin A干预人结肠癌LS174-T细胞后，PTEN和p-Akt的表达情况及VEGF、MMP-9蛋白分泌水平变化，探讨Psammaplin A在结肠癌LS174-T细胞增殖和凋亡中的分子机制。
　　1 资料与方法
　　1.1 材料
　　人结肠癌细胞株LS174-T实验室保存；Psammaplin A购自沈阳药科大学；CCK-8购自上海同仁研究所；DNA-Prep Reagent System 试剂盒、Elite ESP型流式细胞仪均由美国Coulter公司生产；MMP-9、VEGF ELISA Kit购自武汉优尔生科技股份有限公司；PTEN、p-Akt多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养 LS174-T细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃饱和湿度、5% CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长。
　　1.2.2 MTT法测定Psammaplin A对LS174-T细胞的生长抑制 细胞生长至对数增长期，按1×104个/ml的细胞浓度接种于96孔板，每孔200 μl。设空白组（调零组）、对照组（无Psammaplin A干预）和实验组。实验组包括：不同浓度的Psammaplin A干预组（10、20、50、100、200μmol/L）和Psammaplin A不同培养时间干预组（24、48、72h）。各组分别设6 个复孔。贴壁培养24 h后换无血清培养基过夜培养。次日，在RPMI-1640培养液中依据不同的实验设计加入Psammaplin A进行干预。实验结束后，每孔加入20μl MTT溶液(5g/L)，充分混匀后置于37℃、5% CO2孵箱中继续孵育4h。每孔加入150μl DMSO，振荡10min，用酶联免疫检测仪读取每孔的吸光度(A)值(OD570)，绘制细胞生长曲线。按公式：[(b-a)-(c-a)]/(b-a)×100%计算细胞的增殖抑制率。实验重复3次。
　　1.2.3 流式细胞仪检测Psammaplin A干预LS174-T后的细胞周期 选取10、50、200μmol/LPsammaplin A即低中高三个药物浓度干预LS174-T细胞48h进行细胞周期分析，同时设置对照组（无药物干预组）。培养不同时间后收集细胞用PBS洗涤3遍，70％乙醇悬浮细胞4℃过夜。然后PBS洗涤2遍，碘化丙啶染色30 min，检测分析[3]。
　　1.2.4 蛋白免疫印迹检测PTEN和p-Akt的表达情况 当细胞生长到对数期时，用10、50、200μmol/L的Psammaplin A干预LS174-T细胞，并设计对照组（无药物干预组）。培养48h后，离心收集。收集到的细胞用预冷的PBS漂洗2遍，加入适量的细胞裂解液及蛋白酶抑制剂置冰上30 min后，以12000r/min于4℃离心10min，调整蛋白浓度，加入5×SDS-PAGE 加样缓冲液，置95～100℃沸水中变性5min。80V恒压电泳后，过夜转至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5h，TTBS洗膜后，加1：1000稀释后的一抗，37℃孵育1.5h。加HRP标记二抗37℃孵育40min。洗膜，ECL显影。
　　1.2.5 ELISA法检测细胞培养上清VEGF、MMP-9的分泌水平 细胞生长至对数增长期，按5×104个/ml的细胞浓度接种于96孔板，每孔200μl。贴壁培养24h后换无血清培养基过夜培养。用10、50、200μmol/L的Psammaplin A干预LS174-T细胞。每个浓度梯度设立3个复孔，同时设立空白对照孔，48h后收集细胞培养上清液，离心后-80℃保存备用。用ELISA试剂盒检测VEGF、MMP-9水平，操作按ELISA试剂盒说明书进行。
　　1.2.6 统计学方法 运用SPSS 10.0统计软件分析数据，数据以x-±s表示，用t检验分析差异显著性，以P≤0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 Psammaplin A对LS174-T细胞增殖的影响 MTT实验检测结果显示：当Psammaplin A浓度为10μM时，细胞增殖抑制未能显示统计学差异; 当Psammaplin A浓度为50μM、100μM和200μM时，从24h细胞即显示显著抑制，与对照组 (Psammaplin A为0μM )比较，细胞增殖抑制显著(P&<0.05)。Psammaplin A对人结肠腺癌细胞株LS174-T增殖的抑制呈现出一定的时间依赖性和剂量依赖性，LS174-T结肠腺癌细胞的增殖抑制率随着Psammaplin A作用时间的延长和浓度的增加而增加，剂量在50μM时的，细胞增殖开始受到显著的抑制。
　　2.2 不同浓度Psammaplin A对LS174-T细胞周期分布的影响 不同浓度Psammaplin A干预LS174-T后48h细胞周期结果分析表明，DNA合成期(s期)细胞比例明显减少并呈现出剂量相关性，Psammaplin A可同时诱导G0/G1和G2/M期阻滞，且G0/G1阻滞更为明显。 　　2.3 Psammaplin A干预下LS174-T细胞中PTEN和p-Akt表达情况 结果显示，10、50、200μmol/L的Psammaplin A干预LS174-T细胞PTEN的表达量随Psammaplin A干预浓度增加而增加，而p-Akt的表达量随Psammaplin A干预浓度增加而明显下降。PTEN的表达量与p-Akt的表达量呈现负相关。
　　2.4 Psammaplin A对细胞上清中VEGF、MMP-9的分泌量影响 结果分析可知，在Psammaplin A干预LS174-T细胞的上清液中，VEGF、MMP-9的分泌量随着Psammaplin A的干预浓度增大而降低。且与对照组相比P&<0.05，有显著差异。
　　3 讨论
　　Psammaplins化合物是一类从海洋海绵体生物中分离出来的酚类化合物，对多种肿瘤细胞具有细胞毒性作用。对Psammaplin A的最新研究结果表明其作为一种低毒的天然药物，可有效抑制皮肤癌、结肠癌、肺癌、肝癌等癌症疾病，是一种潜在的肿瘤化学预防剂。然而Psammaplin A抗肿瘤效应的分子基础未完全阐明，因此探讨Psammaplin A在抗肿瘤中的作用机制，对Psammaplin A在临床上应用于恶性肿瘤的防治有重要的意义。
　　大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国发病率呈逐年递增趋势，国内外经过数十年的研究，对大肠癌发生、发展、生长、调控、侵袭和转移等问题有了进一步的认识，其发生发展是涉及多因素、多步骤、多基因参与的病理过程，不仅有原癌基因的表达激活，而且与抑癌基因的调控有着密切的关系。抑癌基因PTEN具有双特异性磷酸酶(DSP)活性，在酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶介导的信号转导过程中具有重要的作用，可以通过磷酸化与去磷酸化的动态变化调节细胞的正常生长。Akt的持续活化与肿瘤的发生发展密切相关，已被定义为癌基因。活化的Akt通过磷酸化MDM2，P21，cyclinD2，FXHR，TSC2，Foxo，bcl-2家族等多种作用底物，促进肿瘤细胞的生长、增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞侵袭和转移，促进血管生成，抵抗化疗和放疗中细胞的凋亡。有文献报道PTEN过度表达的细胞表现为Akt的磷酸化水平的显著降低，PTEN可通过拮抗Akt通路促进BAD和forkhead的活性及抑制NF-κB的活性，最终诱导凋亡的发生。另外PTEN可能通过下调MMP-9的表达进而抑制肿瘤的浸润与转移，通过抑制VEGF表达来抑制细胞的细胞增殖。
　　本文研究发现，Psammaplin A可有效降低人结肠癌LS174-T的存活率，并呈剂量依赖型。进一步证明了Psammaplin A的抑癌作用。流式检测结果表明Psammaplin A干预后S期的DNA合成明显受到抑制，LS174-T细胞被阻抑在G0/G1。Western Blot检测PTEN和p-Akt的表达情况发现，PTEN和p-Akt的表达随着Psammaplin A干预浓度的变化，存在一定的相关性。推测PTEN基因的表达可影响Akt的磷酸化。活化后的Akt能够促进肿瘤细胞的生长、增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞侵袭和转移，促进血管生成，抵抗化疗和放疗中细胞的凋亡。ELISA实验同时检测到VEGF、MMP-9随着Psammaplin A的干预浓度增大而降低。VEGF的表达与肿瘤的分期和增殖关系密切，而VEGF 的表达与p-AKt有明显的相关性。推测Psammaplin A干预LS174-T后，p-Akt 量增多抑制VEGF 的表达，推测可以约束VEGF 诱导的癌细胞迁移。p-AKT蛋白表达增加，可能激活MMP-9，使细胞发生癌变，并促进癌变细胞的浸润和转移。因此Psammaplin A抑癌的分子机制可能是由于Psammaplin A上调表达了PTEN，进而影响胃癌细胞中p-AKt的量降低，进一步抑制了AKt引起胃癌细胞的增殖、运动、侵袭和转移。
　　细胞增殖及凋亡的调控是细胞因子间相互作用、相互影响而形成的复杂网络，Psammaplin A抑制人胃癌细胞增殖及促进其凋亡的作用，还可能通过多种因子多种途径来实现。随着研究的的不断深入，相信Psammaplin A的多种抑瘤作用的分子机制将逐渐被阐明。
参 考 文 献
[1]J emal A， Siegel R， Ward E， et al. Cancer statistics 2007. CA Cancer J Clin， 2007， 57:43266.
[2]Goswami A，Ranganathan P，Rangnekar VM.The phosphoinositide 3-kinase/Akt1/Par-4 axis:a cancer-selective therapeutic target.Cancer research，2006，66(6):2889-2892. 转贴于