作者：李晓娜 马德庆 王立萍
凝血酶激活的纤溶抑制物(Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor，TAFI)是近年来发现存在于血浆中的一种蛋白酶原，属于羧肽酶家族成员[1]。血液凝固时，TAFI被凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物激活后，可特异性裂解与纤溶酶原有高亲和力结合位点的纤维蛋白羧基末端的赖氨酸残基，从而抑制纤溶酶原的活化，下调纤溶活性。作为凝血与纤溶新的调控因子，TAFI的发现在医学和生物学界引起了很大的兴趣。国外已进行了多项TAFI的研究，研究发现TAFI与多种疾病的病理状态，尤其是与血栓性疾病关系密切，血浆中高水平的TAFI是静脉血栓和心血管疾病的危险因素[2]。而国内对TAFI的研究甚少，为此我们用ELISA测定了50例健康人血浆中TAFI抗原(TAFI:Ag)水平，并建立了我们当地健康人群血浆TAFI∶Ag的参考值范围。
1 研究对象选择
选取我院体检中心2011年3月至2011年5月的50例年龄20-70岁之间排除心、脑血管疾病和肝肾疾病、体检正常的健康者，男31例，女19例。所有入选者检测前半个月内未使用抗凝药物，且无肝肾功能异常。
2 标本采集与处理
空腹静脉采血2份，其中一份注入凝血专用的试管，收集上层血浆置于-80℃保存备用；另一份注入生化专用的试管。
3 主要仪器和试剂
TAFI试剂盒均购自American Diagnostica公司（批号：873）； Rayto RT-2100C酶标分析仪；罗氏7600全自动生化分析仪及配套试剂。
4 实验方法
4.1血浆TAFI Ag水平采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定
4.1.1标准曲线的建立 血浆标准品制作1∶2，1∶4，1∶10，1∶20稀释。将不同稀释度的参考血浆，每孔加200μl，置37℃中孵育2h；倾倒尽孔中液体，用洗涤缓冲液300μl洗涤5次，甩干，加酶标抗体每孔200μl，置37℃中孵育1h；同上洗涤5次；TMB底物每孔200μl，室温放置5min，0.45mol/L硫酸溶液，每孔50μl，终止反应。酶标仪选择450nm波长进行读数，以各稀释度的TAFI为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，建立标准曲线。
4.1.2待测样品的检测 血浆用稀释缓冲液作1∶50稀释，其余操作同标准品，根据标准曲线上的吸光度值可换算出待测样品中TAFI∶Ag的含量。
4.2生化指标测定 空腹血糖、肝肾功能均在罗氏7600全自动生化分析仪上测定。
5 数据处理与统计学分析
采用SPSS13.0统计软件对所获得的数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用正态分布法估计正常参考值范围。
6 结果
6.1试验方法学评价
6.1.1准确度 将0.9mL的低值标准血浆加入0.1mL的高值标准血浆TAFI，计算TAFI∶Ag的平均回收率为96.56%。
6.1.3精密度 同一份血浆标本批内重复测定10次，TAFI∶Ag的变异系数为3.96%。
6.2血浆TAFI∶Ag水平 血浆TAFI∶Ag均值为(84.86±19.56) %，以双侧95%的可信区间计算出血浆TAFI∶Ag水平的正常参考值范围为45.74%-123.98%。
7 讨论
TAFI是1988年Hendriks等首先用比色法在血清中发现的一种羧基肽酶，由于它的不稳定性，被称为不稳定羧基肽酶(CPU)。1991年Eaton等人从血浆中分离到血浆羧基肽酶原B。1994年CPU被证明是血浆羧基肽酶B。1995年Bajzar[1]等从血浆中分离出了分子量约为60Kd 的单链蛋白质，对其氨基酸测序分析发现该蛋白质与1991年Eaton等分离的血浆羧基肽酶原B为同一物质。至此，对TAFI的研究日益深入。
现已清楚TAFI主要由肝脏合成的单链糖蛋白，分子量为60000，含有423个氨基酸残基。TAFI基因定位于染色体13q，完整的TAFI基因全长约48kb，其中有一个约70bp的序列使其能在肝脏内特异性转录。通过Southern印迹分析发现人的TAFI基因存在两种亚型，但两者无功能上的差异。启动子和3′非翻译区存在7个多态性位点，这些多态性位点恰好位于TAFI基因的转录调节区域，从而决定了TAFI的表达水平。编码区存在2个多肽性位点（Ala147Thr，Thr325Ile），后者与TAFI的活性有关[3]。TAFI 在体外激活后对温度高度敏感，在37℃时半减期为15min，在30℃时为45min，在22℃时可延长到数小时，但在-80℃保存14天仍有90%的活性。目前认为活化的TAFI自发性结构改变是此酶活性丧失的主要原因[4]。由于TAFI的活性极其不稳定，本实验尚未进行TAFI活性的检测。
TAFI∶Ag是血栓性疾病新的实验室检测指标，因此测定结果的准确性就显得非常重要。本实验中进行的试验方法学评价证明ELISA结果的可信性，血浆TAFI∶Ag正常参考值与国外文献报道基本一致。我们的检测结果显示正常人群血浆TAFI∶Ag水平有较大差异，可能与TAFI的基因多态性位点有关。
参 考 文 献
[1]Bajzar L，Manuel R，Nesheim ME. Purification and characterization of TAFI， a thrombin activatable fibrinolysis inhibitor [J]. J Bio Chem， 1995，270，14477～14484.
[2]Juhan-Vague I， Renucci JF， Grimaux M， et al. TAFI antigen levels and cardiovascular risk factors [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol ， 2000，20 (9) : 2156.
[3]Brouwers GJ，Vos HL，Leebeek FW， et al. A novel possibly functional single nucleotide polymorphism in the coding region of the thrombin activatable fibrinolysis inhibitor(TAFI) gene is also associated with TAFI levels [J].Blood ，2001，98(6):1992-1993.
[4]Marx PF， Hackeng TM， Dawson PE， et al. Inactivation of active thrombin activable fibrinolysis inhibitor takes place by a process that involves conformational instability rather than proteolytic cleavage[J].J Biol Chem，2000，275:12410-12415.