作者：韩彤亮 蔡湘丽 李梅 宋达琳 赵仲堂 康维强
【摘要】 目的探讨冠心病病人载脂蛋白(Apo)A5基因变异与冠心病及其脂代谢异常的相关性，并分析其在冠心病发病机制中的作用。方法随机选择非亲属山东汉族冠心病及其脂代谢异常病人275例(冠心病组)，以年龄和性别相匹配的正常人289例作为对照组，采用聚合酶链反应-限制性内切酶片断长度多态性分析，结合全自动测序技术，检测两组ApoA5 SNP3、SNP4 位点基因型，同时检测血脂水平。结果经Logistic回归分析校正，冠心病组SNP3位点TC基因型与对照组比较差异有显著性(χ2=4.08，P&<0.05)，且为独立影响因素。ApoA5 SNP3与ApoC3-482C/T基因间的连锁不平衡与对照组比较具有一定的差异。冠心病组SNP3 TC基因型三酰甘油水平明显高于其他两种基因型(F=7.56，q=4.69、4.32，P&<0.05)。结论SNP3与冠心病的遗传易感性相关;SNP4通过影响血脂代谢水平增加冠心病的易感性;单倍体优势是冠心病遗传易感性的重要因素之一。
【关键词】 冠状动脉疾病;血脂异常;载脂蛋白A类;基因型
[ABSTRACT]ObjectiveTo study the correlation of genovariation of apolipoprotein A5 (Apo) with coronary artery disease (CAD) and its abnormal lipid metabolism.MethodsThe present study consisted of 275 CAD patients with abnormal lipid metabolism， who were selected in random from non-relatives of Han people of Shandong province; and 289 healthy subjects matching with age and gender served as controls. The gene variation of apolipoprotein series including ApoA5 SNP3 and SNP4 were identified by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism and DNA sequence，and plasma lipid levels measured as well. ResultsAfter Logistic regression analysis， the frequency of ApoA5 SNP3 TC in the patients was significantly higher than that of the control group (χ2=4.08，P&<0.05)， which was a independent influencing factor. The strong linkage disequilibrium was reflected between ApoA5 SNP3 and ApoC3-482C/T in CAD group. In CAD patients， the levels of triglyceride (TG) were significantly higher in ApoA5 SNP3 TC compared with the other two genotypes (F=7.56;q=4.69，4.32;P&<0.05).ConclusionApoA5 SNP3 is associated with genetic predisposition of CAD， and SNP4 increases the susceptibility of CAD through effecting lipid metabolism. The haploid dominance is one of important factors of genetic predisposition of CAD.
[KEY WORDS]coronary disease; dyslipidemias; apolipoproteins; genotype
脂蛋白代谢异常是动脉粥样硬化发生的最主要原因[1]。研究显示，载脂蛋白(Apo)基因变异可能与冠心病及其脂代谢异常相关[2]，ApoA5是新近发现的血脂代谢的主要调节基因，但有关ApoA5基因多态性变异与高脂血症和动脉硬化的关系，尤其在冠心病的发生、发展中意义尚无定论[3-4]。本研究通过病例对照研究，观察山东沿海汉族人群ApoA5基因多态性对冠心病以及脂代谢的影响。现将结果报告如下。
1对象与方法
1.1研究对象
冠心病组病人均为山东沿海非亲属关系汉族人群，经冠状动脉造影证实为冠心病病人，共275例，男155例，女120例;年龄48～71岁，平均(59.2±9.8)岁;其中稳定型心绞痛126例，不稳定型心绞痛87例，陈旧性心肌梗死62例;并高血压68例，高脂血症92例。以连续3年体检血脂、肝肾功能等各项检测指标正常，无既往冠心病史的289例健康人作为对照组，男163例，女126例;年龄50～69岁，平均(61.6±10.7)岁。所有研究对象均排除其他系统疾病。两组性别和年龄比较差异无显著性。
1.2方法
1.2.1血标本采集两组(冠心病组于停服降脂药物1周后)取空腹静脉血3 mL，EDTA抗凝备用。
1.2.2基因型检测参照文献[4]设计合成引物，ApoA5 SNP3上游引物序列5′-GATTGATTCAA-GATGCATTTAGGAC-3′，下游引物序列5′-CCCC-AGGAACTGGAGCGAAATT-3′;SNP4上游引物序列5′-GTGCCTGTCACCACCGTTTGG-3′，下游引物序列5′-ATGCATTAGCCTCTGCTGTTG-3′，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;采用美国Promaga公司全血提取基因组DNA试剂盒提取基因组DNA，经定量后稀释至20 μg/L备用。在美国STRATAGENE系列定量PCR仪上进行PCR反应，反应体积为20 μL，含DNA 40 ng，上下游引物均为0.2 μmol/L， 200 μmol/L的各种dNTP，0.5 U的Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。反应条件为：首先96 ℃预变性2 min;然后94 ℃变性15 s、退火40 s，72 ℃延伸20 s，共进行30个循环;最后72 ℃延伸10 min。RFLP分析以及测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，测序仪为ABI 377，测序方法为末端终止法。取PCR产物16 μL，内切酶1 U，无菌去离子水补充至20 μL，37 ℃过夜消化，终产物经20 g/L的琼脂糖电泳分析确定基因型。
1.2.3血脂和脂蛋白的测定采用酶法测定三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白(HDL-C)的含量，采用免疫比浊法测定低密度脂蛋白(LDL-C)的含量，在OLYMPUS全自动生化仪上完成上述检测。
2结果
2.1两组血脂水平比较
冠心病组TC、TG和LDL-C水平均明显高于对照组，差异有显著意义(t=2.21～11.62，P均&<0.01)，两组HDL-水平比较差异无显著意义(t=0.24，P&>0.05)。见表1。
2.2两组ApoA5基因型分布比较
两组检测对象ApoA5基因型和等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡规律，具有群体代表性。两组人群中ApoA5 SNP3位点基因型均以TC型多见，其次为TT型，而后为CC型;ApoA5 SNP4位点基因型均以TC型多见，其次为CC型，而后为TT型。两组SNP3位点TC基因型比较差异有显著性(χ2=4.08，P&<0.05)。见表2。
2.3两组各基因型间血脂水平比较
冠心病组ApoA5 SNP3位点的TT和CC基因型病人的TG水平较TC基因型病人显著降低(F=7.56，q=4.69、4.32，P&<0.05);冠心病组ApoA5 SNP4位点的CC和TT基因型病人的TG、TC水平较TC基因型病人显著降低(F=9.49，q=3.76～12.92，P&<0.05);HDL-C和LDL-C水平比较差异无显著性(P&>0.05)。见表3。
2.4单倍体型和连锁不平衡分析
ApoA5最常见的单倍体型用7个SNP变异确定，本研究以ApoA5 SNP3和S19W(C56C&>G)位点大致确定单倍体型，计算单倍体型频率和连锁不平衡系数(D)。 结果显示，冠心病组ApoA5 SNP3-ApoC3-482C/T基因间的连锁不平衡与对照组相比较，有一定差异。冠心病组ApoA5 SNP3-ApoC3-482C/T单倍体型明显高于对照组(χ2=3.42，P&<0.05)。见表4。表1两组血脂水平比较表2两组ApoA5 SNP3和SNP4基因型比较表3冠心病组SNP3和SNP4各基因型血脂水平的比较表4两组ApoA5-ApoC3基因间连锁不平衡系数
本研究结果显示，两组人群中ApoA5 SNP3位点基因型均以TC型多见，其次为TT型，而后为CC型;两组SNP3位点TC基因型比较差异有显著性(P&<0.05);冠心病组ApoA5 SNP3的TT和CC基因型病人TG水平较TC基因型显著降低;冠心病组ApoA5 SNP4的CC和TT基因型病人的TG、TC水平较TC基因型病人显著降低，HDL-C和LDL-C水平比较差异无显著意义(P&>0.05)。表明ApoA5 SNP3可作为独立的冠心病易感基因，而SNP4 位点是否为冠心病的遗传标记不能确定。
研究显示，绝大多数种族人群的ApoA5 SNP3位点多态性影响其血浆TG水平，而血浆TG水平是引起冠心病的独立危险因子，因而可以推测基因多态性可能是通过影响血浆TG和LDL-C 水平而间接影响冠心病的发生。PENACCHIO等[4]在对高加索人群ApoA5区域SNP位点检测之后认为，SNP1、SNP2和SNP3构成常见的单倍体ApoA5*1，且与TG水平相关，而SNP4与TG无关;MARTIN等[5]对SNP4位点分析认为，在白种人青年男性中SNP4不伴父辈心肌梗死遗传，对TG也无显著影响，但TC基因型与TC和 LDL-C水平密切相关;我国毕楠等[6]也得出了SNP3可能与冠心病的发生密切相关的结论，而且SNP3基因型显著影响TG的水平，而这些作用在ApoC3-482C&>T位点的分析上则没有表现出来。这些研究均属于关联分析，对于发现疾病易患基因有较强的敏感性，其结果不一的可能原因是由于种族不同、样本量差异等因素的影响。此外遗传现象比较复杂，除了基因突变外，染色体减数分裂和同源染色体重组，以及其他机制如线粒体遗传、父母基因活性不同、甲基化等现象，使预期的Mendal遗传模式被扰乱。
本文的研究结果显示，冠心病组ApoA5 SNP3-ApoC3-482 C/T单倍体型高于对照组，差异有统计学意义，提示冠心病这种多基因遗传病需要多个基因同时出现变异。TALMUD等[7]通过体外实验方法使ApoA5某些SNP位点发生单个变异，检测是否影响ApoA5基因转录和表达，结果显示，ApoA5中的SNP3位点变异没有引起TG水平的改变，虽然没有同时做几个位点的协同作用研究，但研究者否认这些SNP位点的多态性对TG 的影响。推测临床ApoA5 SNP位点的多态性对TG改变的影响可能是由于与ApoC3的连锁不平衡所致，ApoA5-ApoC3基因簇可能存在连锁不平衡。
综上所述，SNP3与冠心病的遗传易感性相关，SNP4通过影响血脂代谢水平增加冠心病的易感性，单倍体优势可能是冠心病遗传易感性的重要因素之一。
参考文献
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