关于大剂量维生素C对外周血细胞活性的影响

　　　　　　 作者：薛美兰 张秀珍 马爱国 姜秀波 张金玉

【摘要】 目的 观察大剂量维生素C（VC）对外周血淋巴细胞增殖活性、抗DNA氧化损伤能力以及红细胞膜流动性的影响。方法 将48只Wistar大鼠随机分为对照组、A、B、C共4组，分别给予含VC为0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的饲料，实验期为8周。实验结束后无痛处死动物并取血，测定血浆VC、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，红细胞膜谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性、红细胞膜流动性、淋巴细胞增殖活性，单细胞凝胶电泳计数彗星细胞测量DNA氧化损伤水平。结果 与对照组比较，A组血浆SOD活性明显增高（F=2.987，q=4.24，P&<0.05），血浆MDA含量明显降低(F=4.176，q=4.23，P&<0.05)，红细胞膜流动性和外周血淋巴细胞增殖活性均明显增高（F=2.278～2.763，q=3.67-3.84，P&<0.05）；C组的血浆VC含量明显升高（F=3.235，q=4.63，P&<0.01），SOD和红细胞膜GSHPx活性明显降低（F=2.987、3.478，q=3.68～4.13，P均&<0.05），MDA含量明显增高（q=4.08，P&<0.05）。10 μmol/L h3O2诱发DNA损伤B组和C组较对照组均加重（F=4.137，q=3.94、4.25，P&<0.05）。结论 较高剂量VC（2 000 mg/kg）可明显增高大鼠机体的抗氧化损伤水平，改善红细胞膜流动性，提高淋巴细胞的增殖活性；当VC剂量超过5 000 mg/kg时，反而会加重淋巴细胞的DNA氧化损伤。
【关键词】 抗坏血酸；超氧化物歧化酶；膜流动性；淋巴细胞活化；DNA损伤

　　维生素C（VC）是一种水溶性维生素，具有抗氧化活性。一般认为VC是水溶性的，不能在体内蓄积，摄入较高剂量不会对机体产生危害。已知超大剂量服用VC会产生副作用，包括胃胀气、腹泻、呕吐等。有一项体外研究指出，VC抗氧化作用与其剂量有密切关系[1]，过大剂量的VC（0.5 mmol/L）可能增加细胞DNA对h3O2或其他有害物质损害的敏感性。目前，健康机体摄入高剂量的VC是否有不良影响尚无定论。本实验通过体内实验对大鼠进行超出生理需要量数倍的大剂量VC干预，观察大剂量VC对健康幼年大鼠外周血淋巴细胞增殖活性和抗DNA氧化损伤能力以及红细胞膜流动性的影响及其可能机制。现将结果报告如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物分组及处理
　　
　　幼年Wistar大鼠48只，雌雄各半，分笼饲养，体质量80～100 g，由山东大学实验动物中心提供。基础饲料适应性喂养1周后，随机分为对照组、A、B、C共4组，每组12只，分别给予含VC为0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的饲料（在基础饲料中添加VC并充分混匀，低温压制并经循环风自然干燥，饲料制成后立即放入-20 ℃冰箱中保存）。各组动物自由饮水，环境温度维持在23～25 ℃。实验期为8周。基础饲料的成分组成（%）：面粉20，玉米粉30，豆面15，麸皮25，鱼粉5，骨粉1，食盐1，酵母粉1，色拉油2，核黄素0.004，鱼肝油0.04。
　　1.2 检测指标及方法
　　1.2.1 血样采集 大鼠处死前12 h撤掉食物，应用200 g/L的乌拉坦麻醉后经腹主动脉取血，留取800 μL红细胞，按低渗一步溶血法[2]制备红细胞膜备用，并同时分离淋巴细胞。其余全血离心获取血浆置于-20 ℃冰箱中保存待测。
　　1.2.2 血浆VC测定 采用2，4二硝基苯肼法。
　　1.2.3 血浆超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及红细胞膜谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性测定SOD活性测定采用羟胺法，GSHPx活性测定采用DTNB直接法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法。SOD、GSHPx、MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
　　1.2.4 红细胞膜流动性测定 采用Lowry法测蛋白，调整膜蛋白的浓度为200～800 mg/L， DPH荧光标记红细胞膜。应用美国PE公司LS50型荧光分光光度计测荧光偏振度，Ex 362 nm，Em 432 nm，狭缝10 nm，温度25 ℃，按文献[4]公式计算荧光偏振度P值和微黏滞度η值。
　　1.2.5 外周血淋巴细胞增殖活性的测定 采用ELX 2800酶标仪(美国BioTek公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定。
　　1.2.6 DNA氧化损伤分析 采用单细胞凝胶电泳或彗星电泳技术检测[3]，取新鲜抗凝血30 μL，经分离获取淋巴细胞，分别应用0、10、25 μmol/L的h3O2氧化处理5 min。将DAPI荧光染色的细胞核在荧光显微镜下观察100个“彗星”细胞，根据拖尾的长度衡量DNA链断裂损伤程度（AU）[4]。
　　1.3 统计学处理
　　
　　采用SPSS 11.0和PPMS 1.5[5]统计软件进行数据处理，数据间比较采用单因素方差分析。
　　2 结果
　　2.1 各组血浆VC、SOD、MDA含量和红细胞膜GSHPx活性比较
　　
　　与对照组比较，A组血浆SOD活性升高（F=2.987，q=4.24，P&<0.05），MDA含量显著下降（F=4.176，q=4.23，P&<0.05）；C组的血浆VC含量明显升高（F=3.235，q=4.63，P&<0.01），SOD活性明显下降（q=4.13，P&<0.05），MDA含量明显升高（q=4.08，P&<0.05），红细胞膜GSHPx 活性明显下降（F=3.475，q=3.68，P&<0.05）。与A组比较，B组和C组MDA含量明显升高（q=4.73～5.20，P&<0.01），SOD活性明显下降（q=3.58～3.65，P&<0.05）；C组的血浆VC含量明显升高（q=4.51，P&<0.01），红细胞膜GSHPx 活性明显下降（q=3.84，P&<0.05）。 见表1。
　　表1 各组血浆VC、SOD、MDA含量和红细胞膜GSHPx活性比较（略）
　　与对照组比较，F=2.987～4.176，*q=3.68～4.63，P&<0.05；与A组比较，#q=3.58～5.20，P&<0.05
　　2.2 各组大鼠淋巴细胞增殖活性的比较
　　
　　对照组淋巴细胞增殖活性为0.042±0.036，A组为0.111±0.115，B组为0.049±0.059，C组为0.041±0.047。与对照组比较，A组的外周血淋巴细胞增殖活性明显升高（F=2.278，q=3.67，P&<0.05）；与A组比较，C组的淋巴细胞增殖活性明显降低（q=4.19，P&<0.05）。
　　2.3 各组大鼠红细胞膜流动性的比较
　　
　　与对照组比较，A组红细胞膜P、η值显著升高（F=2.458、2.763，q=3.84、4.23，P&<0.05）；与A组比较，C组红细胞膜P、η值显著下降（q=4.61、6.54，P&<0.01）。见表2。
　　2.4 各组大鼠淋巴细胞DNA氧化损伤的比较
　　
　　与对照组比较，A、B、C各组大鼠0、5 μmol/L的h3O2诱发的DNA氧化损伤的差异均无显著性（F=0.485、0.250，P&>0.05）。B组和C组大鼠10 μmol/L的h3O2诱发的DNA氧化损伤增高，差异有显著性（F=4.137，q=3.94、4.25，P&<0.05）。
　　见表3。
　　表2 VC对红细胞膜流动性的影响（略）
　　与对照组比较，F=2.458、2.763，*q=3.84、4.23；与A组比较，#q=4.61、6.54，P&<0.01
　　表3 各组大鼠淋巴细胞DNA氧化损伤情况比较（略）
　　与对照组比较，F=4.137，*q=3.94、4.25，P&<0.05
　　3 讨论
　　
　　VC为一种六碳糖酸的烯二醇内酯，易溶于水，为水溶性维生素，人体摄入生理量的VC之后，在消化道几乎被全部吸收，其吸收的比例随摄入VC量的增加而下降。一般认为，VC是水溶性的，不能在体内蓄积。本文结果显示， 10 000 mg/kg剂量组血浆VC含量明显高于对照组和2 000 mg/kg剂量组，提示摄入大剂量的VC超过了机体的代偿能力，肾小管不能完全排除过量的VC，最终导致血浆VC水平上升。

　VC是最主要的细胞外液抗氧化物，在细胞内液也有重要的抗氧化活性。本文结果显示，摄入较大剂量（2 000 mg/kg）的VC可明显提高大鼠血浆SOD活性，降低血浆MDA含量，改善红细胞膜流动性，提高淋巴细胞的增殖活性。MDA为脂质过氧化终产物之一，一般来说，活性氧损伤加重伴随着MDA升高，而抗氧化剂对活性氧的清除作用表现为MDA的降低，膜流动性提高提示对活性氧的清除能力加强。因此，补充含2 000 mg/kg VC饲料时，大鼠对活性氧的清除增加，提高了细胞功能。
　　
　　但是，补充过高剂量VC(超过5 000 mg/kg)引起血浆SOD活性降低，MDA含量升高，红细胞膜GSHPx活性明显下降，对红细胞膜流动性、淋巴细胞的增殖活性没有明显的保护作用，甚至在h3O2诱导损伤时，反而造成淋巴细胞DNA损伤加重。SELMAN 等[6]研究显示，长期大量补充VC对小鼠的寿命和氧化应激损伤没有影响，反而会减少内源性抗氧化剂基因的表达。有研究指出，VC在一定条件下具有促氧化剂作用，健康人膳食中补充大剂量VC（500 mg/d）可产生促氧化剂活性，而给大鼠大剂量VC可显著增高单氧酶活性，并使O-2的活性上升，继而可能导致DNA损伤[7]。HININGER等[8]研究显示，应用含大剂量VC（5 g）的EDTA螯合疗法治疗糖尿病或心血管疾病时，会产生明显的促氧化效应，导致红细胞SOD、GSHPx等抗氧化酶活性下降。因此，当补充VC剂量过大时，引起血浆中VC的蓄积，VC可能发挥其促氧化作用，使自由基生成增加，激发了体内过氧化反应，体内活性氧浓度升高造成细胞氧化损伤，影响细胞功能，导致细胞增殖活性下降。
　　
　　COOKE等[9]对健康人每天补充VC 500 mg，血中和尿中DNA氧化损伤产物8OHdG水平下降，VC水平升高，且二者之间呈较强的相关性。ANDERSON等[10]将人外周血淋巴细胞（含血清）与不同剂量的VC共同作用0.5 h，结果显示，VC有促进DNA链断裂的作用，且有剂量反应关系。VC可破坏DNA的碱基和脱氧核糖，使DNA链降解。补充较大剂量的VC时，由于VC可能具有增加带有着丝粒和非着丝粒微核形成的倾向，可作为前氧化物损伤着丝粒或纺锤丝蛋白或作为一种纺锤丝断裂剂造成DNA损伤的微核率增加[11]，从而促进DNA的诱导损伤。提示补充大剂量VC 加重DNA损伤。
　　
　　综上所述，健康机体摄入适宜剂量的VC即可以满足抗氧化损伤的需要，维持细胞功能活性的稳定。过量补充VC对健康机体红细胞膜流动性和外周血淋巴细胞没有保护作用，反而会使机体抗氧化损伤能力下降。其作用机制有待进一步阐明。
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　　[6]SELMAN C， MCLAREN J S， MEYER C， et al. Lifelong vitamin C supplementation in combination with cold exposure does not affect oxidative damage or lifespan in mice， but decreases expression of antioxidant protection genes［J］. Mech Ageing Dev， 2006，127:897904.

　　[7]PAOLINI M， POZZETTI L， PEDULLI G F， et al. The nature of prooxidant activity of vitamin C［J］. Life Sci， 1999，64:273278.

　　[8]HININGER I， WATERS R， OSMAN M， et al. Acute prooxidant effects of vitamin C in EDTA chelation therapy and longterm antioxidant benefits of therapy［J］. Free Radic Biol Med， 2005，38:15651570.

　　[9]COOKE M S. Repair action of vitamin C upon in vivo oxidative DNA damage［J］. FEBS Lett， 1998，439(3):363367.

　　[10]ANDESON D， YU T W， PHILLIPS B J， et al. The effect of various antioxidants and other modifying agents on oxygenradicalgenerated DNA damage in human lymphocytes in the COMET assay［J］. Mutation Res， 1994，307:261271.

　　[11]ODAGIRI Y， UCHIDA H. Influence of serum micronutrients on the incidence of Kinetochore positive or negative micronuclei in human peripheral blood lymphocytes［J］. Mutation Res， 1998，415:3545.

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