作者：马伟平 何大馨 钟丹丹 张蓓
【摘要】 目的探讨白细胞介素21(IL-21)在慢性乙型肝炎中的免疫调节作用。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测32例慢性乙型肝炎病人(病人组)和29例健康人(对照组)血清中IL-21水平。提取外周血单个核细胞后分别设为IL-21刺激组、IL-2刺激组和未刺激组，多色流式分析技术检测CD8+T细胞频率，胞内细胞因子染色技术检测CD8+IFN-γ+T细胞的频率。 结果与对照组相比，病人组血清中IL-21浓度明显增高(t=2.75，P&<0.01);与IL-2刺激组和未刺激组相比，IL-21刺激组CD8+T细胞频率及分泌IFN-γ水平显著升高(F=59.27、10.27，q=3.82~14.11，P&<0.01)。结论IL-21通过对CD8+T细胞的免疫调节效应参与慢性乙型肝炎病人体内病毒的清除，为临床治疗提供了新的靶标。
【关键词】 白细胞介素21;肝炎，乙型，慢性;CD8+T细胞;免疫调节
[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the role of IL-21 in patients with chronic hepatitis B (CHB).MethodsSerum IL-21 in 32 patients with CHB and 29 healthy subjects were determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). After extraction of peripheral blood mononuclear cell， a setting of IL-21-stimulus， IL-2-stimulus and not-yet stimulus group was made. HBV DNA was analyzed with RT-PCR. The frequency of CD8+ T cells was analyzed by flow cytometry， and that of IFN-γ by intracellular cytokine straining.ResultsCompared with the controls， the serum concentration of IL-21 in CHB was markedly higher (t=2.75，P&<0.01); compared with IL-2 stimulus and not-yet stimulus， the frequency of CD8+ T cells and secretion of CD8+IFN-γ+ T cells dramatically increased (F=59.27，10.27;q=3.82-14.11;P&<0.01).ConclusionIL-21 involves in eli-mination of viruses in the body of patients with CHB through immunological regulation of CD8+ T cells， which provides a new target for clinical therapy of the disease.
[KEY WORDS]interleukin-21; hepatitis B， chronic; CD8+ T cells; immune regulation
我国是全球乙型肝炎病毒(HBV)感染高流行区，HBV携带者超过1亿人，现症慢性乙型肝炎病人约3 000万，每年新增病例50万～100万[1-2]。尽管预防性HBV疫苗已经在全球广泛应用，但慢性持续性HBV感染率仍居高不下，严重威胁着人类的健康。目前，由于尚不清楚HBV感染后乙型肝炎慢性化的确切机制，所以无法制定出行之有效的治疗方案。因此，明确该机制，可望为乙型肝炎的临床治疗提供新的线索和可靠的理论依据。白细胞介素21(IL-21)是近年来发现的一种细胞因子，属于Ⅰ型细胞因子家族，主要是由CD4+T细胞合成和分泌。人类的IL-21基因定位于4q26-27，鼠类的IL-21基因位于3号染色体[3]。最近研究证实，在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)慢性感染中，IL-21担负着重要作用，并与病毒的清除直接相关，这一重大发现为HBV慢性持续感染的研究带来了新的思路。本研究旨在探讨在慢性HBV感染过程中，IL-21担负着怎样的作用?对乙型肝炎特异性CD8+T细胞是否存在免疫调控作用?
1对象与方法
1.1研究对象
慢性乙型肝炎病人32例(病人组)，男20例，女12例;平均年龄(41.2±13.6)岁。病人均来自青岛市市立医院，诊断符合2000年全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议(西安)制定的标准，均排除合并肿瘤及自身免疫性疾病者。健康对照组29例，男18例，女11例;平均年龄(37.2±9.5)岁。
1.2主要试剂和仪器
美国BD公司产FACS Calibur型流式细胞仪。美国宝特公司产酶标仪。CD3-PE、CD8-FITC、IFN-γ-APC等均购自美国BD公司。HBV血清标志物ELISA检测试剂盒由上海实业科华科技有限公司提供。IL-21试剂盒购自美国TPI公司。
1.3IL-21水平检测
采用双抗体夹心ELISA方法检测受试者血清IL-21水平。取受试者血清及标准液各50 μL加入酶标板，37 ℃孵育30 min;每孔加酶标抗体50 μL，37 ℃孵育30 min。洗涤5次加底物显色;终止反应后，采用酶标仪测定吸光度(A)值，以A值计算IL-21水平。
1.4外周血单个核细胞(PBMC)的提取
将淋巴细胞分离液加入到10 mL尖底离心管中;用毛细吸管加入等量的倍比稀释血液，2 000 r/min离心25 min。使用毛细吸管轻轻吸取白膜层的PBMC，洗涤后使用含体积分数0.10胎牛血清的RPMI 1640培养液重悬细胞，培养于6孔板中备用。分为以下3组：IL-21刺激组(加入20 μL的IL-21)、IL-2刺激组(加入20 μL的IL-2)、未刺激组(不加IL-21和IL-2)。共孵育10 d后，检测CD8+T细胞的数量及功能。
1.5流式细胞分析技术检测CD8+T细胞频率
肝素抗凝的全血200 μL加2 mL PBS稀释后，1 000 r/min离心5 min;用吸管小心移弃上清液;分别加20 μL以PE标记的CD3、FITC标记的CD8抗体于全血细胞中，设置同型对照，混匀;室温避光孵育30 min;洗涤;加FACS裂解液，室温10 min;待细胞悬液变成真性溶液后洗涤2次;以10 g/L多聚甲醛200 μL重悬固定，流式细胞仪检测CD8+T细胞频率，BD FACS 专用FACSpA软件分析。
1.6特异性肽刺激活化胞内IFN-γ染色
3组孵育10 d后，分别加入20 μL以PE标记的CD3、FITC标记的CD8单克隆抗体及同型对照，室温避光孵育20 min;然后加入1× FACSTM穿透液500 μL，室温下避光孵育15 min;洗涤1次;分别加入20 μL荧光标记的IFN-γ抗体及同型对照，室温下避光孵育20 min;洗涤2次，重悬于10 g/L多聚甲醛溶液200 μL 中，上机检测。
1.7统计学处理
数据以±s表示，使用STATA 7.0及PPMS 1.5[4]统计软件进行统计学处理。多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组血清IL-21浓度比较
对照组和慢性乙型肝炎病人组血清IL-21浓度分别为(196.33±114.56)、(274.18±106.22)ng/L，与对照组相比，病人组血清IL-21浓度明显增高(t=2.75，P&<0.01)。
2.2CD8+T细胞频率
与未刺激组及IL-2刺激组相比，IL-21刺激组CD8+T细胞的频率明显增高，差异有显著性(F=59.27，q=11.39、14.11，P&<0.05)。见表1。
2.3CD8+T细胞胞内IFN-γ的检测
与未刺激组及IL-2刺激组相比，IL-21刺激组CD8+IFN-γ+T细胞频率显著增高，差异有显著性(F=10.27，q=3.82、6.28，P&<0.01)。见表1。表1各组CD8+T细胞和 CD8+IFN-γ+T细胞频率比较
在HBV感染中，HBV作为嗜肝的DNA病毒，本身对肝细胞并没有损害;而在清除胞内HBV和肝细胞的损伤中均起关键作用的是CD8+T细胞，即细胞毒性T细胞 (CTL)。在急性HBV感染中，可激发强烈的、多克隆的表位特异性CTL反应;而在慢性感染中，这些反应是微弱的甚至缺失的，造成CTL反应低下的原因仍有待于研究[5-6]。传统理论认为，CD4+T细胞通过分泌IL-2，促进CD8+T细胞的增殖及免疫学效应。而在慢性乙型肝炎中，这种功能薄弱，于是有学者期望通过提高IL-2的分泌，改善CD8+T细胞的功能，促进病毒的清除，以期达到治疗目的，但是临床效果甚微，说明尚未找到其真正的作用靶标。
近期研究结果提示，IL-21在慢性感染中可发挥免疫调控效应。在LCMV慢性感染模型中，若敲除IL-21基因可严重影响LCMV的清除[7-9]。这一重大发现为我们的研究带来新的思路。本研究结果显示，乙型肝炎病人血清中IL-21含量增高，提示其在HBV感染中担负着一定的作用。为揭示IL-21发挥免疫学效应的机制，本研究设置不同组观察其对CD8+T细胞数量的影响，结果显示，用IL-21刺激后，CD8+T细胞数量显著增高，且超过IL-2的刺激效应，说明CD4+T细胞可以通过分泌IL-21而刺激病毒特异性CD8+T细胞的增殖，这一新发现是对传统概念的突破。
近年来研究结果提示，CD8+T细胞识别HBV感染肝细胞表面的靶抗原后，主要通过两种途径发挥免疫学效应。以往对HBV的清除机制主要倾向于CD8+T细胞对靶细胞的直接杀伤作用，即通过穿孔素和颗粒酶的释放等使病毒和感染细胞 “同归于尽”。近来越来越多的研究证据使这一传统学说受到挑战，目前认为CTL的非细胞损伤的病毒清除机制占优势地位。CD8+T细胞介导的细胞无损伤的病毒清除主要是通过细胞因子的释放，如IFN-γ和TNF-α等，达到清除病毒的目的[10-11]。为验证IL-21在促进CD8+T细胞数量增高时是否会改善其功能，本研究利用流式细胞分析技术并胞内细胞因子染色技术观察了IL-21对不同组CD8+T细胞胞内IFN-γ分泌情况的影响，结果显示，加入IL-21刺激后，CD8+T细胞分泌IFN-γ功能增强。
综上所述，IL-21在慢性乙型肝炎中担负着重要的免疫调节效应，其通过改善CD8+T细胞的数量及功能，帮助清除病毒。本研究结果为慢性乙型肝炎的治疗提供了新的思路。
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