作者：盛存见 徐平 常青 刘旭 吴玉辉 于仁斌 盛存见
【摘要】 目的 观察3种不同保护剂对液氮冻存同种带瓣大动脉组织结构影响，寻求最佳冷冻保护剂。方法单独使用0.1 mol/L二甲亚砜(对照组)及单独使用0.1 mol/L海藻糖（实验组1）和0.1 mol/L二甲亚砜+0.1 mol/L海藻糖(实验组2)作为冷冻保护剂，用光镜及电镜对新鲜组织及液氮保存6、9、12个月的带瓣大动脉进行形态学观察。结果 随着保存时间的延长，3组结构破坏均逐渐加重。光镜下观察，保存超过6个月后，3组形态学与新鲜组织比较均有改变（d=17～30，P&<0.01），3组之间比较差异有显著意义（d=6～13，P&<0.01、0.05）。电镜下观察， 保存6、9、12个月时，对照组的同种带瓣大动脉组织的超微结构改变十分明显，实验组1改变较对照组轻，实验组2的结构改变最轻。结论 海藻糖对液氮保存的带瓣大动脉有较好的保护作用; 单独使用0.1 mol/L海藻糖保护效果优于单独使用0.1 mol/L二甲亚砜，二者联合应用保护效果明显好于单独使用。
【关键词】 同种瓣;低温保存;海藻糖
［ABSTRACT］ Objective To compare the effects of three cryoprotectants on the structure of allogenetic aortic valves preserved in liquid nitrogen (LN) and search for the optimal one. Methods The allograft preserved in 0.1 mol/L DMSO served as control group; in 0.1 mol /L trehalose as experiment group 1， and in 0.1 mol/L DMSO plus 0.1 mol /L trehalose as experiment group 2. The morphology of the fresh tissue and that had been preserved by LN 6， 9 and 12 months was observed lightmicroscopically and electronmicroscopically. Results The structures of the tissues in the three groups were increasingly destroyed with prolongation of preservation duration. Lightmicroscopically， the morphology of the tissues in the three groups after six months of preservation was changed as compared with that of fresh tissues (d=17-30，P&<0.01). The differences among the three groups were significant (d=6-13;P&<0.01，0.05). Electronmicroscopically， the changes of the ultramicrostructure of the aortic tissue in the control group were dramatically after 6， 9 and 12 months of preservation， the changes in group 1 was milder， and that in group 2， the mildest. Conclusion Trehalose is a good cryoprotectant for the allogenetic aortic valve preserved in the LN. The cryoprotective effect of trehalose combined with DMSO is better than that of trehalose and DMSO alone.
［KEY WORDS］ allogenetic valve; cryopreservation; trehalose
海藻糖是一种广泛存在于酵母、真菌、海藻和许多生物体内的非还原性双糖，由两分子葡萄糖通过半缩醛羟基脱水而成[12]。其在固体状态下为白色结晶状体，相对分子质量为378.33，化学性质极稳定，水溶液无色无臭，口感略带甜昧。海藻糖可稳定细胞膜、蛋白质和核酸结构，对生物具有独特抗脱水、抗冷冻、抗高渗的保护作用，其作为一种天然的非特异性生物保护物质而倍受关注[3]。为验证其保护作用，本实验将海藻糖作为冷冻保护剂保存同种带瓣大血管6、9、12个月，通过光镜及电镜进行观察，现将结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
体质量为3 kg左右的健康家兔16只(由青岛大学医学院动物中心提供)。二甲亚砜(DMSO)、M199 均为Sigma 公司产品，海藻糖为上海试剂二厂产品。程控降温仪由中国军事医学科学院生产。XTU10C光学显微镜为上海豫光仪器有限公司产品，JSM840扫描电镜、JEM1200EX透射电镜为日本JEOL公司产品。
1.2 方法
1.2.1 取材
空气栓塞处死兔后开胸，无菌操作取带瓣主动脉，用Hank液洗去残血，修剪。每只兔的主动脉分3段，共48个标本，随机分为新鲜组、对照组(单独使用DMSO)、实验组1（单独使用海藻糖）、实验组2(使用DMSO加海藻糖)，每组12个标本。
1.2.2 保存方法
无菌条件下将材料置于冻存管内，首先在4 ℃冰箱平衡20 min，放入程控降温仪(Cryo2Cyl LP，Forma Scientific) 用两步法降温:1 ℃/min 降温至-30 ℃，再以5～10 ℃/min 降温至-80 ℃，移入液氮贮存冰(CRYOPLUS2，Forma Scientific)。分别在6、9、12个月后复温检测。各组冷冻保护液成分如下。对照组: 0.1 mol/L DMSO，RPMI 1640，体积分数0.10胎牛血清，青霉素和链霉素各105 U/L。实验组1: 0.1 mol/L 海藻糖， RPMI 1640， 体积分数0.10胎牛血清，青霉素和链霉素各105 U/L。实验组2:0.1 mol/L海藻糖，0.1 mol/L DMSO， RPMI 1640， 体积分数0.10胎牛血清，青霉素和链霉素各105 U/L。
1.2.3 解冻及漂洗
从液氮中取出带瓣膜动脉，去掉布袋检查外层冷冻袋无破损后立即浸入40 ℃温水中。待营养液解冻后剪去内层冷冻袋的顶部，将带瓣膜动脉取出放入40 ℃含体积分数0.10胎牛血清和0.1 mol/L DMSO 的M199液中，轻轻搅动以促进完全解冻。然后，用“等级系列漂洗法”漂净组织中DMSO。最后，在纯净的M199 液中平衡15～30 min，使组织恢复弹性。
1.2.4 细菌学检查
灭菌前后，解冻后动脉壁和瓣叶以及营养液取样，送细菌室做细菌培养， 37 ℃培养72 h无细菌生长为细菌培养阴性。
1.2.5 光镜标本制作
在每个带瓣大动脉组织的不同部位取3 mm3大小的组织3块，经40 g/L中性缓冲甲醛液固定，乙醇脱水、浸蜡，包埋及切片，常规苏木精伊红、醛复红染色，光镜下观察。
1.2.6 电镜标本制作
透射电镜标本制作:锐利刀片取材，约1 mm3 大小，每个带瓣大动脉组织取5块，以戊二醛固定，0.1 moL/L磷酸缓冲液浸洗，10 g/L四氧化锇固定，升级乙醇脱水，环氧树脂812包埋，LBRV 型超薄切片机切成厚700 μm 的切片，醋酸铀及醋酸铅双重染色，OPKON 109 型透射电镜下观察并摄片。扫描电镜标本制作：取5 mm长的条形样品，戊二醛固定，系列丙酮脱水， 临界点干燥， 真空镀铂后观察。
1.2.7 统计学处理
采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理。光镜观察结果比较用等级秩和检验。
2 结 果
2.1 肉眼观察
新鲜的带瓣大动脉血管壁外观为白色，柔韧性好，瓣膜为乳白色。冷冻保存各组带瓣大动脉的外观和瓣膜测试结果与新鲜组相比无明显差异。细菌及真菌培养结果均为阴性。
2.2 光镜观察
新鲜带瓣大动脉组织游离表面被覆单层扁平内皮细胞，其下面的纤维较为致密。醛复红染色示弹力纤维平行分布，弹力层下胶原纤维组织排列成束并与表面平行。以内皮细胞和内弹力膜破坏程度为标准分为3级：内皮细胞和内弹力膜正常(Ⅰ级)，内皮细胞脱落(Ⅱ级)，内皮细胞脱落伴内弹力膜破坏(Ⅲ级)。新鲜带瓣大动脉组织均为Ⅰ级，保存超过6个月后，3组形态学与新鲜组织比较均有明显改变（d=17～30，P&<0.01），3组之间比较差异有显著意义（d=6～13，P&<0.01、0.05）。见表1。表1 各组同种瓣保存不同时间光镜观察结果比较（略）
2.3 电镜观察
2.3.1 扫描电镜观察
取冻存12个月的标本进行观察，对照组内皮大量脱落基本观察不到，大量胶原纤维暴露，基膜断裂（图1）；实验组1基膜部分断裂（图2），可见残存的内皮细胞（图3）；实验组2可见大量内皮细胞，内膜完整无纤维暴露（图4）。
2.3.2 透射电镜观察
对照组：保存6个月时，平滑肌细胞线粒体可见空泡（图5），核膜部分断裂；保存9个月时，核膜破坏，线粒体空泡化严重；保存12个月时细胞器溶解破坏严重。实验组1：保存6个月时，平滑肌细胞结构正常，核膜完整（图6），内质网及线粒体形态正常；保存9个月时，平滑肌细胞线粒体出现空泡，内弹力膜部分断裂溶解；保存12个月时，内弹力膜断裂溶解，核膜破坏不完整，上皮完全脱落。实验组2：保存6个月时平滑肌细胞保存排列整齐，细胞器结构完整（图7）；保存9个月细胞结构变化不大，上皮基本无脱落（图8）；12个月时电镜下可见上皮部分脱落，平滑肌细胞内线粒体、粗面内质网结构清晰，内弹力膜及核膜仍尚完整。
同种带瓣大动脉的来源有限，且采集后不立即使用，因此保存就显得非常必要。低温尤其是液氮深低温方法保存同种带瓣大动脉可使细胞内酶的活性下降，代谢率降低，保存时间长且临床效果非常显著[45]。但是液氮保存可影响瓣膜的组织代谢和活性，破坏其结构的完整性，其程度随时间延长而加重。并且在低温条件下，大部分细胞由于内外环境中水都会形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，即造成细胞内结构机械性损伤，进一步使细胞电解质升高，脱水、死亡，从而降低细胞存活率。因此，要在冻存的过程中加入保护剂。
冷冻保护剂包括非穿透性和穿透性两类保护剂。穿透性保护剂如甘油、DMSO、丙二醇、乙二醇等，可以渗入细胞内，控制结晶过程，保护细胞免受损伤。非穿透性保护剂如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、羟乙基淀粉等，其分子质量大于等于蔗糖，形成细胞外的高渗，使细胞脱水，减少细胞内冰晶的形成。目前，在同种带瓣大动脉的冻存中得到一致公认并且应用广泛的是DMSO。
海藻糖作为一种非还原性二糖，具有保护生物细胞和活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。海藻糖是一种非穿透性冷冻保护剂，很多研究认识到生物体在逆境下都能通过体内调节合成海藻糖来抵御外界不良环境的伤害[6]。 然而，其在低温保存中的作用目前并不十分清楚，人们进行了大量探索，目前主要有两种假说。一种称“水替代”学说:生物大分子中蛋白质、糖和脂等均被一层水膜包围着，这层薄的水膜是维护其结构和功能必不可少的，干燥时水膜失去，将导致这些大分子物质发生不可逆变化，加入一定量的海藻糖，则可在失水部位与这些生物大分子形成氢键，使其在缺水条件下仍能保持原结构，而不丧失活性。另一种称“玻璃态”学说:当干燥生物活性物质时，海藻糖紧密地包住相邻近的分子，形成一种在结构上与玻璃相似的碳水化合物玻璃体。海藻糖扩散系数很低，分子运动变性反应非常微弱，能够使生物分子维持一定的空间结构而保持活性。此外，海藻糖有助于避免渗透性保护剂渗入细胞所导致的过度膨胀和渗透性休克。海藻糖能代替脂质分子头部基团间的水分子，降低膜的相变温度，防止重新水化时脂质状态转换及伴随出现的裂缝。
近年来，在低温保存过程中，国内外研究的共识是非穿透性和穿透性两类保护剂混合使用，从而产
生最理想的协同保护作用，合用DMSO和海藻糖作为冷冻保护剂，可以取得良好效果[3]。在DMSO中加入海藻糖，能大大提高细胞的成活率。在胚胎干细胞的低温保存过程中，在含DMSO的冷冻保护剂处理之前，先用海藻糖处理，将会进一步提高细胞的活性。海藻糖在肺、气管、皮肤、肾脏、红细胞、血小板等组织细胞的低温保存方面也显示提高了保存组织细胞的活性。由于海藻糖对组织细胞的低温保存具有保护作用，其也被应用到角膜的低温保存研究中，WUSTEMAN等[7]采用丙二醇联合海藻糖玻璃化法保存角膜也取得了较大进展。王连召等[8]通过对犬冷冻气管的研究证实， 0.1 mol/L DMSO+0.1 mol/L海藻糖是目前冷冻气管的最佳冷冻保护剂配方。
在液氮保存时加入DMSO作为保护剂其保护作用已经得到公认，但是许多研究也证实随着时间的延长，同种瓣膜的形态结构和代谢都存在不同程度的破坏，这也是影响其使用效果的一个主要因素。对海藻糖作为冷冻保护剂的研究无疑为以后同种瓣膜的保护剂提供了一种选择。
组织结构是反映同种瓣膜是否具有活性的一个重要指标，组织结构主要通过形态学观察，如使用电镜和光镜。本实验中在光镜下可以看出，新鲜同种瓣膜的组织结构最完整，说明新鲜瓣膜最大限度地保留了组织活力和组织结构；单用海藻糖组的结构破坏较单用DMSO组轻（P&<0.05）。联合应用组的结构破坏明显较单用组轻(P&<0.05)。电镜下也非常直观地看出：同一时间点，单用DMSO组的结构破坏最明显，单用海藻糖组次之，DMSO加海藻糖组最轻。
另外，保存时间的长短也是大家所关注的。有学者研究证实，液氮保存同种瓣膜3个月以内，其组织结构较新鲜瓣膜变化不大。但是毫无疑问，无论加入何种保护剂，随着保存时间逐渐延长，组织结构的破坏是逐渐加重的。通过本实验也可以看出，任何一组随着保存时间延长破坏也加重；同一时间点，即使在最短的6个月DMSO加海藻糖联合应用组，其组织结构与新鲜瓣膜相比也有改变（P&<0.01）。
本研究从形态学变化证实了海藻糖对同种带瓣大动脉的冷冻保护作用。以0.1 mol/L DMSO+ 0.1 mol/L海藻糖作为冷冻保护剂联合应用，程控降温，在液氮中保存同种带瓣大血管，可以明显地提高保护效果。
参考文献
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