关于胃肠道间质瘤的ckit基因突变检测

　　　　　　作者：杨锋 丁宝国 杨堂斗 贺慧颖 钟镐镐 李燕 郑杰 吴秉铨

【摘要】 目的 探讨CD117阳性的胃肠道间质肿瘤（GIST）ckit基因突变分布及类型。方法 采用免疫组化技术，对10例GIST标本行CD117、CD34、SMA和S100检测，以确诊为GIST；采用PCR技术对CD117阳性的GIST进行ckit基因突变检测；采用直接测序方法对突变ckit基因11、9、13和17号的外显子突变进行序列分析。结果 4例成功提取了肿瘤DNA，其中3例检出了ckit基因突变，均分布于第11号外显子，均为557～558（WK）的缺失性突变；其中2例为纯合子性突变，1例为杂合子性突变。结论 CD117阳性的GIST通常有ckit基因突变，其11号外显子是经典分布热点，变异纯合子和杂合子突变为常见类型。
【关键词】 胃肠道间质肿瘤；DNA突变分析；ckit基因
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the locus and types of ckit (CD117) mutations in gastrointestinal stromal tumors (GIST).MethodsSpecimens of 10 GIST cases were detected immunohistologically for CD117， CD34， SMA and S100 to confirm the diagnosis of GIST. For CD117positive GIST， the mutation of ckit was detected by PCR， and its exons 11， 9， 13 and 17 analyzed by direct sequencing technique.ResultsDNA was successfully isolated in four cases， in which， mutation of ckit was found in three cases， all the genes detected were at ckit exon 11 with codon 557-558(WK)， homozygous mutation being noted in two cases and heterozygous in one.ConclusionThere is usually ckit gene mutations in CD117positive GIST， the exon 11 being classic “hot spot” of the mutations. The homozygous and heterozygous are their common types.
　　［KEY WORDS］Gastrointestinal stromal tumor; DNA mutationa analysis; ckit gene
　　胃肠道间质瘤（GIST）是近年来被认识并命名的新实体瘤，CD117（KIT蛋白）是其特异性敏感标志物[1]。GIST具有ckit基因的11号外显子突变，从而导致酪氨酸激酶持续激活[2]。GIST对酪氨酸激酶抑制剂Gleevec治疗敏感[3]。基因诊断和分型为临床深入认识该病提供了重要前提[4]。本文探讨了GIST ckit基因突变分布及类型，现报告如下。
　　1 材料和方法
　　1.1 标本及其来源
　　收集胶南市人民医院外科收治的10例临床病理诊断为GIST的肿瘤石蜡包埋组织标本，其中男6例，女4例，年龄31～72岁。根据临床病理组织学形态特征将GIST分为：梭形细胞型4例，上皮样细胞型3例和两者混合型3例。肿瘤直径&<2 cm、核分裂象&<5/50 HPF（极低度侵袭危险性）3例，肿瘤直径2～5 cm、核分裂象&<5/50HPE(低度侵袭危险性）2例，肿瘤直径5～10 cm、核分裂象&<5/50HPF或肿瘤直径&<5 cm、核分裂象(6～10)/50 HPF（中度侵袭危险性）2例，肿瘤直径&>5 cm、核分裂象&>5/50 HPF或肿瘤直径&>10 cm或核分裂象&>10/50 HPF（高度侵袭危险性）3例。
　　1.2 免疫组化方法
　　将40 g/L甲醛溶液固定、石蜡包埋的组织制成4 μm连续切片，以CD117(A4502，1∶200)、CD34(M7165，1∶50)、SMA(M851，1∶100)、S100(Z231，1∶200) 进行免疫组化标记。CD117免疫标记采用Envision两步法；余者均采用SP三步法[5]。
　　CD117阳性细胞胞膜呈棕黄色；S100阳性细胞胞核和胞质呈棕黄色；CD34、SMA阳性细胞胞质呈棕黄色。
　　1.3 ckit基因突变检测分析
　　用Qiagen DNA 试剂盒提取石蜡包埋组织的DNA，行PCR扩增。所有病例均首先进行ckit 第11号外显子的扩增检测，发现有突变者，不再进行其他突变检测；对11号外显子突变无阳性发现者，再进行ckit 9号外显子的扩增检测；无ckit 9号外显子突变者，再进行13 号和17号外显子的扩增。所用引物序列、退火温度和PCR产物片段大小见表1。表1 PCR扩增引物序列、退火温度和产物片段外显子编号引物序列（略）
　　PCR反应条件为：95 ℃变性2 min；94 ℃ 40 s，退火40 s，72 ℃ 35 s，循环 30～35 次；最后72 ℃延伸5 min。以双蒸水代替模板作为阴性对照。
　　PCR产物由北京华大中生生物科技发展公司纯化并测序（ABI 3100测序仪）。有突变的病例再行反向测序证实，并与NCBI基因库ckit基因序列进行比对。

　2 结果
　　经免疫组化检测CD117、CD34、SMA和S100，确认10例为CD117阳性GIST病例。
　　10例石蜡标本中仅4例成功提取了DNA，并进行了PCR扩增和测序。按细胞类型分为上皮样细胞2例，梭形细胞1例，混合型1例。按侵袭危险性分为高度危险性3例，其核分裂象(8～15)/50 HPF；中度危险性1例，其核分裂象(1～2)/50 HPF。该4例中，有3例检出了ckit基因第11号外显子缺失突变，均为累及557～558（WK）的缺失性突变。其中1例CD117（+）、CD34（），第11号外显子缺失突变，缺失片段为TGGAAGG，为杂合子性缺失突变；1例CD117（）、CD34（），第11号外显子缺失突变；1例CD117（）、CD34（），第11号外显子缺失突变。后两者均为纯合子性缺失突变。1例CD117（+）、CD34（），未检测到11、9、13、17号外显子的突变，属野生型序列。其余6例，经反复提取DNA和检测，均失败。
　　3 讨论
　　本组10例GIST的组织病理学研究显示，GIST肿瘤细胞主要有3种类型：梭形细胞型、上皮样细胞型和梭形细胞与上皮样细胞混合型，但主要以梭形细胞型为常见。组织学检查表明，GIST肿瘤细胞的核分裂象数目差异很大，而且与肿瘤的大小不相关。光镜高倍视野下GIST肿瘤细胞核分裂象数目与肿瘤大小，均为FLETCHER等[6]对GIST侵袭危险度分级的主要指标，在评估病人预后上有重要意义。
　　本文研究结果进一步表明，免疫组织化学几项检测指标，特别是CD117和CD34对GIST的诊断是必需的。95％以上GIST表达CD117阳性，70％左右表达CD34阳性。因此，CD117和CD34是GIST病理诊断和鉴别诊断的关键性免疫形态学指标。GIST从组织学上，被认为来源于胃肠道间质中的Cajal细胞和其前身细胞[7]，这两种细胞都显示CD117和CD34阳性表达；SMA和S100则是用于鉴别平滑肌和神经源性肿瘤的免疫学指标。
　　本研究对10例GIST组织进行ckit基因突变检测分析，目的是揭示肿瘤赖以发生的突变基因靶点，寻找在基因水平上的序列异常改变，帮助临床选择恰当治疗方案。但是，其中6例检测失败。分析失败原因，主要是组织标本处理不规范，造成无法有效提取组织DNA。因此，规范GIST的组织处理过程，是必须首先解决的问题。
　　本组GIST中有3例为ckit基因突变肿瘤，突变位点均位于11号外显子，并表现为纯合子缺失突变和杂合子缺失突变两种类型。ckit基因是一种原癌基因，它的配体是细胞因子，ckit基因被激活后会引起受体的二聚体，并促进酪氨酸磷酸化，启动细胞内的信号传导，产生一系列增殖、分化、凋亡的调节功能。ckit基因11号外显子是酪氨酸激酶抑制剂的靶向位点，因此是Gleevec药物作用的敏感位点。按基因分类诊断，是推荐选择Gleevec靶向治疗药物的适宜对象。而另1例病人的基因突变检测未发现ckit基因9、11、13、17号外显子突变，基因类型为野生型。同时，根据其肿瘤大小和核分裂象分级，属高侵袭危险性GIST者，免疫组织化学检测其CD117和CD34均为阳性，属对靶向治疗药物Gleevec不敏感的GIST肿瘤病人。因此，基因诊断分型是GIST的重要临床指标，为临床治疗提供依据，有重要意义。

参考文献

　　[1]SARLOMORIKALA M， KOVATICH A J， BARUSEVICIUS A， et al. CD117: a sensitive marker for gastrointestinal stromal tumors that is more specific than CD34 [J]. Mod Pathol， 1998，11:728734.

　　[2]HIROTA S， ISOZAKI K， MORIYAMA Y， et al. Gainoffunction mutations of ckit in human gastrointestinal stromal tumors[J]. Science， 1998，279:577580.

　　[3]O’LEARY， JULEO J. Gartromtertinal stromal tumor: answers and question[J]. Human Lathology， 2002，33(5):456458.

　　[4]贺慧颖，项一宁，李燕，等. 胃肠道间质瘤60例中ckit 和PDGFRA 基因突变 [J]. 北京大学学报：医学版， 2005，37(3)：320324.

　　[5]纪祥瑞，姜天福，李玉军，等. 血管免疫母细胞性淋巴结病病变性质的研究[J]. 青岛大学医学院学报， 2004，40(1):17.

　　[6]FLETCHER C D， BERMAN J J， CORLESS C， et al. Diagnosis of gastrointestinal stromal tumor: a consensus approach[J]. Hum Pathol， 2002，33:459465.

　　[7]SEIICHI H， KOJI I. Pathology of gastrointestinal stromal tumors[J]. Pathology International， 2006，56:19.

转贴于