关于bcl2反义寡核苷酸对小细胞肺癌细胞NCIH69放射敏感性的影响

【摘要】 目的 研究bcl2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCIH69放射敏感性的影响。方法 将NCIH69细胞培养传代，然后将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组，通过脂质体将不同寡核苷酸导入细胞中，用WesternBlot法检测Bcl2蛋白的表达。 采用直线加速器分别以不同剂量(0、2、4、6、8、10 Gy)X线照射4组细胞。收集照射后的细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率，MTT法测定细胞存活分数。结果 WesternBlot杂交显示反义寡核苷酸组无Bcl2蛋白表达，相对正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组及空白对照组Bcl2蛋白表达明显受到抑制(F=7.24～15.31，q=5.03～7.80，P&<0.01)。细胞经X线照射后，反义寡核苷酸组细胞凋亡率明显高于空白对照组，差异具有显著性(F=7.24～15.31，q=5.03～7.80，P&<0.01);正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组相比无统计学差异。4组细胞接受辐射后，反义寡核苷酸组在未照射和照射不同剂量后的存活分数均低于空白对照组，差异有统计学意义(F=11.04～45.56，q=5.10～14.75，P&<0.01)，而正义寡核苷酸和无义寡核苷酸组与空白对照组比较则无统计学差异。结论 bcl2反义寡核苷酸能有效封闭bcl2基因的表达，增强小细胞肺癌细胞NCIH69对X线的敏感性。
【关键词】 基因，bcl2;癌，小细胞；放射疗法，适形;寡核苷酸类，反义
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effect of bcl2 antisense oligodexynucleotides on radiosensitivity of the cell line NCIH69 of human smallcell lung cancer.MethodsCultured NCIH69 cells were pided into antisense oligodexynucleotides (ASODN)， sense oligodexynucleotides (SODN)， nonsense oligodexynucleotides (NSODN) and blank groups. The different Bcl2 oligodexynucleotides were transfected into corresponding cells using Oligofectamine. Expression of Bcl2 was examined by WesternBlot. The different group cells were irradiated by different dose of Xray (0，2，4，6，8， and 10 Gy) via 6MV linearity accelerator， the apoptotic cells were then detected by flow cytometry and cell growth assessed by MTT test.ResultsThe Bcl2 expression in ASODN group was significantly inhibited compared with other groups (F=7.24-15.31，q=5.03-7.80，P&<0.01). The apoptotic rate of ASODN group was significantly higher than that of other groups (F=11.04-45.56，q=5.10-14.75，P&<0.01)， and the survival fraction of ASODN group was significantly lower than that of the others.ConclusionThe bcl2 ASODN enhances the radiosensitivity of the cell line NCIH69 of smallcell lung cancer via blocking bcl2 gene expression.
　　
　　［KEY WORDS］Genes， bcl2; Carcinoma， small cell; Radiotherapy， computerassisted; Oligonucleotides， antisense　　
　　小细胞肺癌被认为是放、化疗敏感肿瘤，但治疗效果不佳，多数小细胞肺癌最终表现为化疗耐药、放疗抗拒。如何提高对放疗抗拒的小细胞肺癌的放射敏感性是肺癌研究的一个重要课题。bcl2基因是近年来发现的一种细胞凋亡调控基因，它在小细胞肺癌中有较高的表达[1～3]。已有研究表明，凋亡控制基因与放疗敏感性有关[4]。本研究将bcl2反义寡核苷酸作用于小细胞肺癌细胞NCIH69，探讨其对小细胞肺癌放疗敏感性的影响及其机制。
　　1 材料和方法
　　1.1 细胞系
　　小细胞肺癌细胞株NCIH69，购于上海午立生物技术有限公司，在含体积分数0.10的胎牛血清的RPMI 1640中培养，于37 ℃体积分数0.05的CO2温箱中孵育。
　　1.2 bcl2寡核苷酸序列
　　

参考文献

[4]合成反义寡核苷酸序列为：5′AATCCTCCCCCAGTTCACCC3′，针对bcl2基因第141～147个密码子合成正义寡核苷酸序列为：5′GGGTGAACTGGGGGAGGATT3′，无义寡核苷酸序列为：5′TCCCACCTCACCTACATCCG3′，以上皆经全链硫代修饰，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
　　1.3 脂质体介导转染寡核苷酸
　　脂质体Oligofectamine Reagent购于Invitrogen Life Technologies公司。细胞分4组：空白对照组，仅转染脂质体；正义寡核苷酸组，脂质体介导转染正义寡核苷酸；无义寡核苷酸组，脂质体介导转染无义寡核苷酸；反义寡核苷酸组，脂质体介导转染反义寡核苷酸。置于6孔板上培养，每孔细胞浓度2×108/L，24 h后清除细胞培养基，无血清培养基OptiMEM清洗2次，每孔重新加入OptiMEM 800 μL，轻轻混匀。取出20 μmol/L的寡核苷酸10 μL、脂质体5 μL分别稀释于175、10 μL的OptiMEM无血清培养基中，将稀释后的寡核苷酸和脂质体混匀，室温下孵育20 min。 每孔加入200 μL寡核苷酸脂质体混合物，置于孵箱内孵育4 h。最后，换用体积分数0.20胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养72 h。
　　1.4 Western Blot免疫印迹法检测Bcl2蛋白
　　将转染后的细胞于RIPA裂解液中裂解，12 g/L SDSPAGE电泳，电转至NC膜上，bcl2鼠抗人单抗为一抗（工作液1∶10稀释），HRP羊抗鼠IgG（工作液1∶10稀释）作为二抗，DAB显色。
　　1.5 X线照射
　　收集转染72 h后的4组细胞，即正义、反义、无义寡核苷酸组和空白组，分别转移至6孔板中，调整细胞数为2×109/L，板上加1 cm厚组织补偿，室温下X线照射（6MV加速器X线，源皮距90 cm）0、2、4、6、8、10 Gy，照射后置于孵箱中，48 h后测定细胞凋亡率。
　　1.6 细胞凋亡率的检测
　　收集照射后48 h的4组细胞，调整细胞数为5×108/mL，以1 000 r/min离心5 min， 弃上清， 冷PBS洗2次，加入50 mg/L PI低渗液（含NP40、RNA酶）200 μL，混匀，4 ℃避光染色30 min，400目筛网过滤。FACS管上样检测DNA含量，激发波长488 nm，CV值&<2％，FSC/SSC设门。收集门内10 000个细胞，用CELL Quest软件分析细胞凋亡率。
　　1.7 MTT测定存活分数
　　收集照射后的4组细胞，调整细胞数为5×107/L。取96孔板，每孔加入200 μL稀释好的细胞，每组设4个复孔，孵箱中培养72 h。每孔加入5 mg/L的MTT各10 μL，继续培养4 h，离心去上清，每孔加入200 μL二甲基亚砜，混匀，用酶标仪检测492 nm波长处的吸光度值，计算存活分数（SF）。SF=实验组的平均吸光值/空白对照组的平均吸光值×100%。每组重复试验3次，取平均值。
　　1.8 统计学处理
　　实验数据以±s表示，用SPSS 11.5软件对结果进行单因素方差分析。
　　2 结果
　　2.1 Bcl2蛋白表达结果
　　WesternBlot杂交结果表明，Bcl2蛋白在空白对照组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组细胞中高表达，在相对分子质量26万处显示清晰的蛋白条带，在反义寡核苷酸组细胞中不表达，在相应位置则未见蛋白条带（图1）。
　　2.2 各组细胞凋亡率比较
　　反义寡核苷酸组在受到不同剂量X线照射后的凋亡率均高于空白组，差异有显著性（F=7.24～15.31，q=5.03～7.80，P&<0.01），而正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组比较则无统计学差异。见表1。表1 不同剂量X线照射细胞48 h后各组细胞凋亡率比较(略)
　　2.3 各组细胞存活分数比较
　　反义寡核苷酸组在未照射和照射不同剂量后的存活分数均低于空白对照组，差异有显著统计学意义(F=11.04～45.56，q=5.10～14.75，P&<0.01)，而正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组比较，差异则无统计学意义。见表2。表2 不同剂量X线照射各组细胞后的存活分数（略）

转贴于 　　3 讨 论
　　在肺癌中，小细胞肺癌约占20%左右。小细胞肺癌具有特异的生物学行为，如恶性度高、生长快、倍增时间短、分裂指数高、早期出现广泛转移、自然生存期短等，临床治疗效果差。放射疗法是治疗恶性肿瘤的主要手段之一。小细胞肺癌对放射治疗较敏感，但很多病人在治疗中出现放射抗拒性。如何进一步提高小细胞肺癌的放射敏感性，从而提高局部控制率和病人生存率，是目前肺癌研究一个重要课题。bcl2是近年发现的细胞凋亡调控基因， 其异常表达与许多肿瘤的发生有关，与小细胞肺癌的关系尤为密切。有研究显示，60%～80%的小细胞肺癌存在Bcl2蛋白过度表达[1～3]。bcl2作为细胞凋亡的重要调控基因，其过量表达可能是导致肿瘤形成和放化疗耐受的主要原因之一。基于bcl2基因的反义治疗可以抑制Bcl2蛋白的表达，诱导细胞凋亡，恢复耐药细胞对化疗药物的敏感性[6]，通过反义技术来封闭bcl2凋亡抑制基因的表达是肿瘤治疗的新思路。本研究采用脂质体转染的方法，将bcl2 反义寡核苷酸导入小细胞肺癌细胞NCIH69中，WesternBlot免疫印迹显示，转染后bcl2 反义寡核苷酸成功封闭了bcl2基因的表达。
　　bcl2基因可导致肿瘤细胞放射抗拒。PILLAI等[7]对宫颈癌研究后发现，bcl2是通过抗氧化途径防止细胞凋亡，认为放疗是通过产生氧自由基造成DNA损害后引起细胞凋亡的， bcl2表达增加可引起肿瘤对放疗的敏感性降低。SIRZEN 等[8]选用U1285、 U1906和U1810等3种放射敏感性不同的肺癌细胞株，检测3种细胞辐射后产生凋亡的不同。结果表明，放射抗拒的U1810细胞株较放射敏感的U1285和U1906细胞株 bcl2/Bax明显增高，提示高表达Bcl2蛋白易产生辐射耐受。本研究采用bcl2 反义寡核苷酸封闭小细胞肺癌细胞Bcl2蛋白表达，经不同剂量X线照射后，细胞存活率明显下降，提高了小细胞肺癌细胞的放疗敏感性。
　　研究表明，肿瘤受单一剂量照射后凋亡指数与放射敏感性呈正相关[4]。日本学者报道，在其实验的5种肿瘤细胞中，放射最敏感的室管膜母细胞瘤细胞辐射诱导的凋亡率最高，最不敏感的恶性胶质瘤细胞凋亡率最低[9，10]。上述资料提示凋亡与放射敏感性密切相关。本研究采用流式细胞仪测定细胞凋亡率，结果接受不同剂量X线照射后，经bcl2 反义寡核苷酸转染的小细胞肺癌细胞凋亡率明显高于其他细胞组。提示促进细胞凋亡是bcl2 反义寡核苷酸产生放疗增敏效应的机制之一。
　　总之，本研究显示bcl2 反义寡核苷酸应用与放疗结合，提高了小细胞肺癌的放疗敏感性，为小细胞肺癌的反义基因治疗与放疗提供了实验基础。
【参考文献】
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