EBV有关胃癌组织中ras基因突变的检测

　　　　　　作者：孙佰秀 刘薇 张璐 罗兵

【摘要】 目的 探讨EBV感染、ras基因突变在EBV相关胃癌（EBVaGC）发生发展中的作用。方法 应用PCRRFLP技术，分别检测13例EBVaGCs、45例与之匹配的EBV阴性胃癌(EBVnGC)以及58例相应癌旁组织中Hras 12位点，Kras 12、13位点突变情况。结果 检测到2例Hras 12位点突变，突变率为4.44%（2/58），均发生在EBVnGC组织。结论 胃癌组织 ras 基因突变率较低，ras基因突变与EBVaGC的发生无明显相关性。
【关键词】 胃肿瘤；疱疹病毒4型，人；基因，ras
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo analyze the pathogenic role of EBV infection and ras mutations in the development of EBVassociated gastric carcinoma (EBVaGC).MethodsRas gene mutations were tested by PCRRFLP assay in 13 EBVaGCs， 45 EBVnegative gastric carcinomas (EBVnGC) with matched clinicopathological parameters and 58 corresponding adjacent tissues of the cancer.ResultsHras 12 codon mutation was detected in two cases of 58 gastric carcinomas (4.44%)， which were in EBVnGC.ConclusionThe rate of ras gene mutations in gastric carcinomas is low. Ras gene mutation is not related with the development of EBVaGC.
　　［KEY WORDS］Stomach neoplasms; Herpesvirus 4， human; Genes， ras
　　EBV相关肿瘤的发生发展是病毒基因表达异常与癌基因、抑癌基因等异常协同作用，导致正常细胞的生长调控发生障碍所致。研究EBV感染和ras基因异常是否参与EBV相关胃癌（EBVaGC）的发生发展以及两者之间有无相关性，有助于深入探讨EBV相关胃癌的生物学特征。本文应用PCRRFLP技术分别检测EBVaGC及对照组织中Hras12位点，Kras 12、13位点突变情况，旨在探讨其在EBVaGC发生发展中的作用，现报告如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 标本及其来源
　　2001年1月～2002年12月，收集青岛大学医学院附属医院126例、青岛市市立医院25例和烟台毓璜顶医院34例共185例胃癌病人手术切除的新鲜胃癌组织和相应癌旁组织（距离癌组织5 cm以上），全部病例均经病理诊断证实。本文自上述185例胃癌病人中选取经病理诊断与原位杂交证实的EBVaGC组织13例[1]，男12例，女1例，平均年龄（59.8±10.2）岁（41～77岁）。肿瘤部位：胃窦部3例，胃体部8例，胃底部1例，残胃1例；组织学分型：低分化腺癌11例，中分化腺癌1例，印戒细胞癌1例。同时，选取同期临床及病理资料与之匹配的EBV阴性胃癌（EBVnGC）组织45例，男35例，女10例，平均年龄（57.9±13.4）岁（31～81岁）。两组病人年龄、性别、肿瘤部位、组织学类型、分化程度等均无显著性差异（P&>0.05）。
　　1.2 组织总RNA提取及cDNA合成
　　酚氯仿异戊醇法常规提取组织DNA，Trizol一步法提取组织总RNA。参照逆转录试剂盒要求的标准条件进行cDNA合成。反应体系为：10×buffer 2 μL，MgCl2 5 mmol/L，dNTP 1 mmol/L，AMV反转录酶15 U，核酸酶抑制剂0.5 U，Oligo(dT)15 0.5 μg，模板RNA 5 μL，加NucleaseFree Water 至终体积20 μL。42 ℃ 1 h，99 ℃ 5 min，然后快速冷却至4 ℃。合成的cDNA用作PCR反应模板，-20 ℃保存备用。
　　1.3 ras基因突变检测
　　1.3.1 引物合成
　　参照文献[2，3]设计并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成检测ras基因突变的特异性引物，同时选择相应的限制性核酸内切酶进行酶切分析，引物序列、扩增产物大小以及所用限制性内切酶见表1。
　　1.3.2 Hras 12位点，Kras 12、13位点扩增
　　PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，DNA模板2 μL，加双蒸水至终体积25 μL。检测Kras 12位点突变的 PCR扩增参数为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 40 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min。检测Kras 13位点突变的扩增参数中退火温度调整为50 ℃， 其余参数均与检测Kras 12位点突变相同。检测Hras 12位点突变的PCR扩增参数为：94 ℃预变性5 min；然后，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。取PCR扩增产物5 μL于含溴化乙锭（0.5 mg/L）的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳（80 V，1 h），紫外线投射仪下观察结果，并与PCR Marker DL2000进行对照分析，若分别观察到162、159和170 bp条带表明扩增成功。
　　1.3.3 限制性酶切反应
　　检测Kras 12位点突变的限制性酶切反应体系为：10×NEB buffer 2 μL，100×BSA 0.2 μL，BstNⅠ5 U，PCR产物10 μL，最后加双蒸水至20 μL，混匀后60 ℃水浴过夜。检测Kras 13位点突变的限制性酶切反应体系为：10× buffer 2 μL，HaeⅢ 5 U，PCR产物5 μL，最后加双蒸水至20 μL，混匀后37 ℃水浴过夜。检测 Hras 12位点突变的限制性酶切反应体系为：10× buffer2 μL，HpaⅡ 10 U，PCR产物5 μL，加入双蒸水至20 μL，混匀后37 ℃水浴1 h。酶切产物于80 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳，溴化乙锭染色，紫外线投射仪下观察结果并拍照。野生型和突变型条带结果判断标准见表1。表1 PCRRFLP检测所用寡聚核苷酸引物和限制性核酸内切酶名称引物序列（略）
　　2 结 果
　　本文2例病人检测到Hras 12位点突变，突变率4.44%（2/58），均发生在EBVnGC（图1～3）。Kras 12位点PCR产物大小为162 bp，野生型酶切产物大小为133、29 bp； Kras 13位点PCR产物大小为162 bp，野生型酶切产物大小分别为85、48及26 bp； Hras 12位点PCR产物大小为170 bp，野生型酶切产物大小为66、56及48 bp，突变型酶切产物大小为122、48 bp。
　　3 讨论
　　EBV是疱疹病毒科γ亚科的淋巴滤泡病毒，大量血清学研究表明，EBV感染十分广泛，几乎遍及世界各地，成年人的感染率可达98%。EBV具有B淋巴细胞嗜性，能够在B淋巴细胞中建立潜伏感染，并可刺激细胞增生和转化。EBV引起的人类疾病主要包括传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤，并与多种恶性肿瘤的发生密切相关。1993年，TOKUNAGA等[4]将经EBER1 ISH证实存在EBV的胃癌细胞定义为EBVaGC。
　　ras基因家族包括Haras、Kiras和Nras，编码产物Ras蛋白有两种结合形式：一种为与GTP结合的活性形式；另一种为与GDP结合的非活性形式。Ras蛋白两种形式的转换可调节细胞生理功能并参与信号传导。在正常细胞中，Ras蛋白可以通过自身GTPase活性从GTP结合的活性形式变为GDP结合的非活性形式；但在肿瘤细胞中， ras基因异常可以干扰GTPase活性，Ras蛋白始终为与GTP结合的活性形式，连续的生长信号刺激可导致细胞恶性增生进而癌变。ras癌基因异常导致肿瘤发生的主要方式为点突变，研究表明，约10%～15%的肿瘤中至少有1种ras基因发生点突变，点突变主要集中在第12、13以及61位点，这些致瘤性点突变降低了Ras蛋白水解GTP为GDP的能力，从而使与GTP结合的活性形式的Ras半衰期延长，持续促进细胞生长。
　　 YOO等[5]采用PCR技术和DNA序列检测，分析了140例美国胃腺癌病人癌组织中ras基因突变情况，结果显示，ras基因点突变率为14%，5例Hras 12位点突变，7例Kras 13位点突变，3例Kras 61位点突变；未发现Hras 13、61及Kras 12位点突变。经统计学分析显示，ras基因点突变与病人年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、组织分化程度以及预后无明显相关性；且不同地区和种族人群ras基因突变无明显差异。

转贴于 郝莹等[6]应用多种方法检测胃癌演变过程中ras基因的突变，结果显示，肠化生、不典型增生以及胃癌组织中Hras 12位点突变率分别为16.7%、31.2%和34.7%，各组间无显著性差异；而浅表性胃炎及正常对照组未发现突变，表明中国人胃癌组织中有一定的Hras突变率。而国外研究结果多显示，胃癌组织中Hras突变率较低甚至检测不到ras基因突变。本文研究结果显示，Hras 12位点突变发生率4.44%（2/58），均发生在EBVnGC，未发现Kras 12、13位点突变，与YOO等[5]和郝莹等[6]的报道有所不同，推测ras基因突变可能存在地区和种族差异[7]。
　　本文13例EBVaGC组织均未检测到ras基因突变，推测EBV感染与ras基因突变在EBVaGC发生中无相关性。EBV感染可能通过其他机制影响细胞的增殖，全面检测其他细胞增殖和凋亡相关基因的表达，将有助于探讨EBVaGC的生物学特征[8]。
　　综上所述，ras基因突变在胃癌的发生中不起主要作用，与EBVaGC的发生无明显相关性。

参考文献

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