关于IL12重组载体的抗肿瘤作用

【关键词】 白细胞介素12 遗传载体 抗肿瘤药 综述
　　细胞因子疗法为临床治疗肿瘤提供了一种安全可行的方法，在目前肿瘤治疗中占有一定地位，已经展示出良好的应用前景。在目前发现的细胞因子中，白细胞介素12（IL12）是对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的一种细胞因子，是最有效的抗肿瘤细胞因子之一。由于直接注射IL12的副作用，介导IL12基因转移进行肿瘤基因治疗是近年的研究热点。近年来，其重组载体被越来越多地应用于临床，使它的作用更好地得到了发挥。本文就IL12的分子结构特征、生物学功能、抗肿瘤作用及IL12重组载体应用的研究作一综述。
　　1 IL12的分子结构特征
　　
　　IL12主要是由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子，永生化的B细胞、CD4+细胞、中性粒细胞和肥大细胞等也可产生IL12[1]。IL12组成的两个亚基P40和P35分别由两个基因编码，单独的P40和P35亚基均不能与IL12受体结合。P35在体内普遍表达，而P40的表达受各种刺激因素的调控，只有两个基因共同表达才能组成有活性的IL12，游离的P40的二聚体蛋白是IL12的天然抑制物。所以，在IL12的基因治疗中，近年来一般将P35和P40融合连接成单链基因片段，以保证二者的均衡表达。IL12有种族特异性，人IL12在鼠中活性很小，鼠IL12在人中则有活性，人与鼠IL12亚基氨基酸序列的比较显示，P40亚基比P35亚基具有更高的保守性，P40亚基序列一致性为70%，相似性为79%；P35亚基序列一致性为60%，相似性为71%[2]。
　　2 IL12的生物学功能
　　2.1 IL12对T细胞和NK细胞的作用
　　
　　IL12可明显刺激静止或激活的外周血T细胞、NK细胞分泌IFNγ，IFNγ与IL12有协同作用，但对于静止的细胞需要辅助细胞的参与。IL12一方面能诱导T细胞和NK细胞产生多种细胞因子，促进细胞毒性淋巴细胞增殖和功能的活化；另一方面在和肿瘤抗原的共刺激下，还能诱导特异性杀伤性T细胞（CTL）的产生，该细胞被认为是杀瘤作用最强的细胞。已发现IL12能促进穿孔素和颗粒酶的表达，增加胞浆内颗粒的产生，上调细胞表面表达多种黏附分子和细胞因子受体[3]。
　　2.2 IL12对Th1/Th3的调节
　　
　　IL12促进Th细胞向Th1细胞分化，不但直接作用于Th1细胞和其前体并产生Ⅰ型细胞因子，如IL2、IFNγ和淋巴毒素（LT）等，还可以在肿瘤坏死因子(TNFα)和IL1协同作用下间接通过T细胞和NK细胞产生TNFγ而实现[4]。在人和鼠，已证明IL12是Th1产生的必需因子，能诱导早期辅助性T细胞分化为Th1，并促进Th1的增殖。在体外当用过敏原作用于CD4+细胞时，导致其生成Th3型细胞；当有IL12存在时，则生成Th1型细胞，分泌IFNγ而不分泌IL4。因此，IL12和IL4作用于CD4+细胞分别支持Th1和Th3细胞的分化[5]。
　　3 IL12的抗肿瘤作用
　　
　　大量动物实验和临床研究表明，IL12能够明显抑制肿瘤的生长和转移，延长荷瘤动物的生存时间。但对IL12抗肿瘤作用及其在不同肿瘤中的作用机制各家报道不同。
　　3.1 IL12介导的T细胞参与抗肿瘤作用
　　
　　IL12不仅可抑制新生肿瘤的生长，而且还可使已存在的肿瘤消退，且其抗瘤活性依赖于剂量。KNUTSON等在HER2/neu抗原提呈T细胞的体外研究中发现，IL12以量效依赖的方式恢复抗原提呈的增殖。p776790特异性T细胞在IL12和IL2刺激后更加容易与抗原发生反应，从而发生增殖反应和分泌细胞因子(IFNγ和TNFα)，这些结果都提示IL12在体外恢复和保持抗原提呈CD4+T细胞中发挥着重要的作用。同时也为CD4+T细胞在肿瘤过继治疗中的应用提供了理论依据[6]。利用重组卡介苗和鼠IL12增加Th1型细胞因子(包括IFNγ和IL12)的分泌，诱导瘤内CD4+/CD8+T细胞和NK细胞的浸润，从而可抑制C3H/HeN小鼠体内肿瘤的增殖。这种抗肿瘤的效应与Th1淋巴细胞和NK细胞介导的细胞毒性免疫反应相关[7]。
　　3.2 IL12通过提高NK细胞活性的抗肿瘤作用
　　
　　在体外，IL12可明显增加人外周淋巴细胞 (PBMC)和NK细胞的活性。可纠正各种实体肿瘤病人的PBMC中NK细胞活性缺陷，在这些病人中用IL12协同IL2，可增加对NK细胞敏感的和不敏感的肿瘤细胞的细胞毒作用。在抗体包被的肿瘤细胞和IL12的双重刺激下，NK细胞可分泌不同效能的免疫刺激细胞因子[8]。
　　3.3 IL12分泌IFNγ参与抗肿瘤作用
　　
　　IL12抗肿瘤作用在很大程度上是由继发分泌的IFNγ所决定的。单独应用IFNγ并不能产生抗肿瘤作用，说明虽然IFNγ的产生对于IL12的抗肿瘤作用是必需的，但是必须有IL12的存在。IFNγ涉及多种抗瘤机制，包括IFNγ与TNFβ相关的直接的细胞毒作用，以及诱导细胞慢性增殖，诱导NO产生，抑制血管生成等。重组人类IL12可刺激CD4+和CD8+T细胞分泌IFNγ，血清IFNγ的水平与抑瘤作用直接相关。细胞凋亡的研究表明，IL12诱导的抗肿瘤机制与CD4+T细胞有关系[9]。
　　3.4 IL12与抑制血管生成
　　
　　已经证明IL12在体内有抗血管形成作用，研究表明，IL12不是直接作用于血管内皮细胞，而是通过诱导IFNγ的产生，后者可能通过诱导CXC趋化因子以及干扰素诱生蛋白10（IP10），从而抑制血管生成，此种抗肿瘤血管生成的作用有助于抑制肿瘤的生长和转移[10]。 IL12刺激NK细胞分泌IFNγ，IFNγ又刺激周围组织中的内皮细胞分泌IP10，IP10可趋化NK、单核、巨噬细胞向反应部位聚集。一旦NK细胞被激活，将表现出强大的细胞溶解和杀伤邻近组织中的内皮细胞作用，抑制新生血管生成。IP10是一个重要的化学因子，在体内有抑制血管生成和抗肿瘤作用[11]。通过这一作用可抑制去除免疫细胞和NK细胞SCID鼠的癌的生长[12]。
　　3.5 IL12诱导巨噬细胞、中性粒细胞等参与抗肿瘤作用
　　
　　巨噬细胞被认为是抗恶性肿瘤的一种重要细胞，它通过产生TNFβ和NO而起作用。IL12能够显著增加肺癌病人胸腔和外周血单核巨噬细胞的杀伤活性，利用IL12孵育的胸腔单核巨噬细胞比外周血单核巨噬细胞能产生更多的IFNγ和IL10[13]。
　　3.6 IL12与肿瘤微环境
　　
　　人类肿瘤微环境包括肿瘤细胞、炎症反应细胞、成纤维细胞、内皮细胞等混合物，它可归于细胞外基质的范畴。很难研究这些细胞在肿瘤发生时相互间的作用及动态变化。有实验表明，异体移植肿瘤中的炎性细胞可抑制肿瘤的生长，而这一作用被认为是由IL12所介导的[14]。
　　4 IL12重组载体抗肿瘤治疗的应用
　　
　　目前已证明IL12对20余种肿瘤有较好疗效，对肺肿瘤、淋巴肿瘤作用较好。但是其全身的副作用和半衰期短的缺点大大限制了其临床应用。人们利用分子生物学技术将其导入质粒或腺病毒的载体中，并使之稳定有效表达，从而克服上述缺点。 全身或肿瘤局部应用重组的IL12使肿瘤萎缩消退，例如，在宫颈癌IL12 Ⅰ期临床试验中发现，IL12的治疗与改善与人类乳头瘤状病毒(HPV)蛋白16中E4、E6和E7肽段的淋巴组织增殖效应有关。但是一些研究发现，IL12达到一定的剂量(1 μg/d)才能较好地发挥作用，这种疗法容易引起脾大等副作用[8]。
　　4.1 IL12重组载体的类型
　　4.1.1 病毒载体 目前病毒载体是基因治疗领域中最常采用的转基因载体，应用各种病毒载体已经成功地将IL12基因导入肿瘤局部并获得表达，显示出良好的抗瘤效应。在基因治疗中应用最多的逆转录病毒载体为内启动子载体，但由于启动子之间存在相互干扰，难以同时表达多个基因，为了得到能协同表达多个基因的逆转录病毒载体，人们利用微小病毒5′端非翻译区具有内核糖体进入位点的功能(IRES)构建了多顺反子逆转录病毒载体核糖体，能与IRES相结合，以帽非依赖方式翻译其下游基因。 以无菌方式瘤内注射给予advhIL12，自给药之日起，每3 d测量瘤体大小，并记录各组动物死亡情况，结果表明具有抗肿瘤作用[6～7]。GRI等[9]将IL12cDNA以逆转录病毒载体介导转移鼠肉瘤细胞，重新接种于鼠体，结果发现其致瘤性消失，并且激发机体的免疫应答，引起其他部位野生型肿瘤的消退。进一步研究表明，早期的抗瘤反应由NK细胞和IFNγ介导，而后期抗瘤免疫力的维持则由T细胞介导，随后将IL12转染的NIH3T3细胞与鼠黑色素瘤BL26细胞混合培养，提示IL12可通过旁分泌方式抑制肿瘤的生长。但这种载体应用于人体的缺陷是不能感染非分裂细胞[7]。
　　4.1.2 重组腺伴随病毒载体 Ⅱ型腺伴随病毒(AAV2)具有对人体不致病，能感染分裂和非分裂细胞等优点，在此基础上经过改造得到的重组腺伴随病毒(rAAV)载体是一种比较理想的基因转移载体，抗瘤效应明显优于其他细胞因子。目前制备多用细胞内同源重组法，有研究选用细菌内同源重组法制备含构建mIL12基因的重组腺病毒载体，从而从根本上克服了细胞内同源重组法的种种缺陷。SEGAL等[8]将mIL12 cDNA以重组腺病毒为载体，瘤内直接注射，发现可显著抑制肿瘤生长以及促进肿瘤转移灶明显消退，显著延长存活时间，而且激发了机体持久的免疫力。组织学观察，肿瘤组织纤维化并伴有严重的炎症反应，瘤组织内浸润的细胞主要为淋巴细胞以及一些巨噬细胞和中性粒细胞。腺病毒载体的缺陷是容易诱发机体产生免疫反应[7]。
　　4.1.3 其他的病毒载体 其他的病毒载体系统如腺相关病毒载体(AAV)以及重组鸟痘病毒载体(ALVAC)介导的IL12基因治疗方案亦显示出良好的疗效。尤其是ALVAC载体，由于其感染宿主范围广，高效表达外源基因，不在哺乳动物细胞内复制，更不会整合于宿主细胞，因而可以安全地用于人体。另外，由于ALVAC/IL12不能整合于宿主基因组中，一次注射，IL12在局部的表达仅能维持有限的时间，因而需要反复瘤内注射[8]。

　　RAKHMILEVICH等将载有IL12 DNA的质粒用基因枪轰击肿瘤生长部位，引起肿瘤消退。在致瘤后每3或4 d注射一次，剂量为每次50 μg，注射5～6次后测各种指标。这种方法的优点是：所携带的IL12基因能较长时间的表达(15～30 d);与其他方法相比基本没有副作用;所引起的NK细胞活性较其他方法高3～4倍。不足的是IL12表达的量较其他方法低一些，但这种方法安全有效，简便，而且适用范围广泛，有望得到进一步完善。直接瘤内注射质粒DNA，一方面可避免载体本身病毒蛋白诱发局部免疫反应对病毒载体的清除；而瘤内注射表达细胞因子的质粒DNA，既可提高病灶局部细胞因子相对浓度，又可降低细胞因子引起的全身副作用，从而产生更好的抗肿瘤效应。质粒载体一般为5.0～7.0 kb。
　　4.2 将编码IL12 的DNA克隆入放射处理后的肿瘤细胞或其他细胞
　　
　　收获自体或异体的肿瘤细胞或成纤维细胞，体外转染携带IL12基因的载体，再重新移植给病人。以自体纤维母细胞为靶细胞转染IL12基因，扩增后直接注入体内；或者与自体肿瘤细胞混合，经外照射后作为肿瘤瘤苗输回人体。在随后进行的临床Ⅰ期试验中，将转染IL12基因的自体纤维母细胞注射于6例黑色素瘤和乳癌病人肿瘤4周，每周1次，结果显示，细胞每天产生300～400 mg/L的IL12，诱导CD4+、CD8+细胞浸润和CD30的高表达以及大量指状细胞的出现[5]。
　　4.3 利用携带IL12基因的病毒或非病毒载体感染或转染肿瘤细胞
　　
　　利用相关重组蛋白和不同的病毒及非病毒转染基因后所表达的IL12都能表现出相当的抗肿瘤活性。在加强肿瘤免疫方面，由于IL12能够诱导NK细胞和T细胞的增殖和活化，因而在免疫应答中起着桥梁的作用。转染携带相关基因腺病毒或逆转录病毒后的肿瘤细胞、DC、肿瘤成纤维细胞都可局部分泌IL12，发挥较好的抗瘤效果[15]。腺病毒介导的协同表达IL12和协同刺激分子B71可消退高免疫性的转移和非转移肿瘤。与单独病毒介导的IL12相比，瘤内注射腺病毒介导的IL12/B71可延长肿瘤免疫应答，可完全消退动物模型中80%的肿瘤[16]。
　　
　　IL12重组载体的转基因治疗今后发展方向主要有:增加基因转染的效率；肿瘤特异主动基因的研究；长期表达及可调控的载体；与其他免疫和非免疫抗癌治疗联合应用。关于IL12重组载体的抗肿瘤基因治疗，已进展到Ⅱ期临床试验阶段。目前总的治疗趋势为单一治疗向联合治疗方案过渡，单一基因治疗向联合多种不同的基因治疗方案过渡。相信随着分子生物学及基因工程技术的进一步发展，IL12重组载体抗肿瘤基因治疗的应用会取得更令人满意的结果。

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