关于低剂量顺铂并IFNα对小鼠移植性肝癌血管生成影响

论文代写网：

【摘要】 目的 了解持续低剂量顺铂(DDP)联合α干扰素(IFNα)对小鼠移植性肝癌血管生成的影响。方法将48只接种h32肝癌的昆明小鼠随机分为4组，各12只。 低剂量DDP组（DDP组）：腹腔注射DDP 0.2 mL(0.6 mg/kg)；IFNα组（IFN组）：皮下注射IFNα 0.2 mL (2×104 U)；低剂量DDP联合IFNα组（联合组）：腹腔注射DDP 0.2 mL (0.6 mg/kg）并皮下注射IFNα 0.2 mL (2×104 U)；生理盐水对照组（对照组）：腹腔注射生理盐水0.2 mL，每天1次，连续2周。观察肿瘤体积、小鼠体质量的变化和药物毒副反应，采用免疫组织化学方法测定肿瘤微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果 DDP组和IFN组肿瘤生长比较缓慢，联合组抑瘤效果更为明显(F=260.58，q=0.72～1.08，P&<0.05)，且毒、副反应未增加。与对照组比较，DDP组和INF组的MVD、VEGF表达均下降(F=157.04、 52.97，q=9.55～19.02，P&<0.05)，联合组下降更显著(q=5.25～9.47，P&<0.05)。结论 低剂量DDP与IFNα联合应用具有明显的抗血管生成协同作用，抑瘤效果显著，毒、副反应小。
【关键词】 顺铂;干扰素α;肝肿瘤;肿瘤微血管密度;血管内皮生长因子
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo evaluate the effect of combined lowdose cisplatin (DDP) with interferonα (IFNα) on angiogenesis in mice with planted hepatoma.MethodsFortyeight Kunming mice planted with h32 hepatoma were evenly randomized into four groups as DDP group: DDP 0.6 mg/kg，intraperitoneal injection; IFN group: IFNα， 0.2 mL (2×104 U)， hypodermic; combination group: DDP， 0.6 mg/kg， intraperitoneal， and IFNα，0.2 mL (2×104 U)， hypodermic; control group: normal saline， 0.2 mL， intraperitoneal. All injections were given once daily for two weeks. Volume and weight of the tumors， as well as weight of the mice were measured. The expression of microvessel density (MVD) and vascular endothelial growth factor (VEGF) was determined immunohistochemically.ResultsTumor grew comparatively slow in DDP and IFN groups，and tumor inhibition was more significant in combination group without increase of any toxicity or adverse reactions (F=260.58，q＝0.72-1.08，P&<0.05). Compared with the controls， MVD and VEGF expressions were lower in DDP and IFN groups (F=157.04， 52.97；q=9.55-19.02；P&<0.05)， and more dramatic decline observed in combination group (q=5.25-9.47，P&<0.05). ConclusionLowdose DDP in combination with IFNα has an obvious joint action of antiangiogenesis， with notable tumor inhibition and less side reactions.
　　［KEY WORDS］Cisplatin; Interferonalpha; Liver neoplasms; Intratumoral microvessel density; Vascular endothelial growth factor
　　肝细胞癌(HCC) 是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前HCC 的治疗仍采取以手术为主的综合治疗，术后复发率高，部分病例就诊时已失去手术时机，5年生存率低。近年来，新生血管在肿瘤的生长、浸润、转移及治疗中的作用倍受关注。已有研究表明，持续低剂量化疗给药，可以靶向作用于肿瘤微血管，达到抑制肿瘤血管生成的作用，并具有毒、副反应小和不易产生耐药的优点［1］，而在合用另一种抗血管生成药物时抑制肿瘤血管生成的作用则更为明显［2］。HCC是典型的多血管肿瘤，抗血管生成在其治疗中有着广阔的前景。本实验将低剂量顺铂(DDP)和抗血管生成药物α干扰素(IFNα)联合应用于荷有h32肝癌的小鼠，观察其对小鼠肝癌血管生成的抑制作用，并观察其抑瘤效果及毒、副反应。现报告如下。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 药品及试剂
　　注射用冻干型DDP，购自齐鲁制药厂；IFNα，购自浙江北生药业汉生制药有限公司；兔抗CD34单克隆抗体，购自武汉博士德公司(工作浓度1∶50)；鼠抗VEGF单克隆抗体(工作浓度1∶50)、通用型PV6001/6002免疫组化试剂盒、DAB显色剂，购自北京中杉金桥公司。
　　1.1.2 实验动物

　　h32肝癌荷瘤种鼠2只，由山东省医学科学院药物研究所提供。雄性昆明小鼠48只，SPF级，5～6周龄，体质量18～22 g，由青岛市药物研究所提供。
　　1. 2 方法
　　1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立［3］
　　无菌操作下抽取荷瘤种鼠乳白色腹水，台盼蓝染色检测细胞成活率(＞95%)。用无菌生理盐水调整细胞浓度至1×1010/L，取0.2 mL于小鼠左后肢腹股沟皮下注射。
　　1.2.2 动物分组及药物注射
　　随机将48只小鼠分为4组，每组12只。低剂量DDP组（DDP组）：腹腔注射DDP 0.2 mL(0.6 mg/kg)[4]；IFNα组（IFN组）：皮下注射IFNα 0.2mL (2×104 U)；低剂量DDP联合IFNα组（联合组）：腹腔注射DDP 0.2 mL (0.6 mg/kg) 并皮下注射IFNα 0.2 mL(2×104 U)；生理盐水对照组（对照组）：腹腔注射生理盐水0.2 mL。在肿瘤接种后第3天开始给药，每天1次，连续2周。接种后第17天称量小鼠体质量并脱臼处死，取瘤组织进行检测。
　　1.3 检测指标
　　1.3.1 瘤体积、瘤质量和抑瘤率
　　接种后，第5天起，用游标卡尺测量瘤体长径和短径，每3 d测1次计算肿瘤体积(瘤体积=短径2×长径/2)。处死小鼠后，用电子天平称量每只小鼠瘤质量，计算各组平均瘤质量，并按下列公式计算抑瘤率。抑瘤率=［(对照组平均瘤质量-用药组平均瘤质量)／对照组平均瘤质量］×100%。
　　1.3.2 小鼠体质量及毒副作用
　　接种后第5天起，每3 d用电子天平称量小鼠体质量1次，计算各组平均体质量。同时，每日观察小鼠饮食、活动及一般状况。
　　1.3.3 肿瘤微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的检测
　　采用免疫组织化学方法。肿瘤组织常规石蜡包埋、切片、脱蜡、水化后，按试剂盒说明进行PV免疫组化二步法染色。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性的切片作为阳性对照。
　　1.3.4 染色结果判定
　　MVD：以CD34单抗标记内皮细胞，任何胞浆染成棕色的内皮细胞或内皮细胞团，均按独立的微血管分别计数，是否有管腔不作为计数的必要条件，管腔大于8个红细胞面积或管壁周围有平滑肌包绕的血管不纳入计数范围。计数时先于低倍镜下选择癌灶浸润最明显处，然后在200倍镜下计数5个视野内微血管数目，取其平均值作为MVD[5]。 VEGF的表达：以胞浆内含有棕黄或棕褐色、颗粒状、定位明确且染色明显的瘤细胞为阳性细胞。每只动物均随机选取5张切片，显微镜下每张切片随机观察10个高倍视野(400倍)，每个视野观察100个细胞，记数VEGF的阳性细胞数，计算VEGF阳性细胞表达率。VEGF阳性细胞表达率＝阳性细胞数/计数细胞总数×100%。
　　1.4 统计学处理
　　计量资料以±s表示，采用SPSS 11.5统计软件对结果进行单因素方差分析。
　　2 结 果
　　2.1 各组小鼠体质量变化和毒、副反应
　　在整个实验期间，各组小鼠体质量均逐渐增加，但在后期对照组小鼠肿瘤负荷较大，与各用药组比较，体质量增加减慢。给药1周后，对照组小鼠食欲下降，皮毛失去光泽，行动迟缓；各用药组小鼠食欲良好，毛色有光泽，行动灵活，且联合组与DDP组和IFN组之间无明显差别。见表1。表1 各组小鼠在给药过程中体质量比较（略）
　　2.2 各组抑瘤效果
　　与对照组比较，DDP组、IFN组及联合组肿瘤生长延缓(F=396.84，q=741.32～1 040.00，P&<0.05)。各用药组的瘤质量均显著性低于对照组(F=260.58，q=0.72～1.08，P&<0.05)，且联合用药组的瘤质量较DDP组和IFN组均显著降低(q=0.37、0.29，P&<0.05)。见表2。表2 各组小鼠给药过程中瘤体积和瘤质量比较(略）
　　2.3 肿瘤组织MVD和VEGF表达水平比较
　　与对照组比较，各用药组肿瘤组织MVD和VEGF阳性表达率均显著性降低(F=157.04、52.97，q=9.55～19.02，P&<0.05)。与DDP组和IFN组比较，联合组的MVD和VEGF阳性表达率均降低，差异有显著意义(q=5.25～9.47，P&<0.05)。见表3。表3 各组小鼠肿瘤组织MVD和VEGF的表达水平比较(略）
　　3 讨论
　　肝细胞癌为血供丰富的实体肿瘤，其发生、生长、浸润和转移均依赖于新生血管的生成，其生物学特性包括高度血管浸润及转移倾向，导致该疾病的预后不良。肿瘤血管形成理论的建立，为研究肝细胞癌复发和转移的机制提供了新的理论依据，同时为治疗肝细胞癌，防止肝细胞癌的复发和转移找到了一种更为有效的治疗手段。肿瘤血管生成是多种血管生成因子、基质蛋白溶解酶以及黏附分子等参与的多步骤复杂过程，是肿瘤生长和转移的必要条件，参与组织血管生成的细胞主要为内皮细胞。VEGF作为一种重要的促血管生成因子，通过与血管内皮细胞的特异受体结合，发挥强大的促内皮细胞增殖、促血管生成的作用。VEGF表达越强，新生血管越丰富。MVD能直接量化反映肿瘤血管生成的程度，是反映恶性肿瘤生物学行为的重要参数，与肿瘤的侵袭、转移及预后关系密切。研究结果显示，肿瘤血管数越多，肿瘤细胞进入血液循环的机会就越大[6]。

转贴于 由于恶性肿瘤的生长和转移有赖于瘤体内血管的形成，抗肿瘤血管生成治疗日益成为人们研究的热点。随着对抗血管生成治疗的不断深入研究，人们对许多细胞毒化疗药物的功能及活性有了新的认识。已有研究表明，传统的细胞毒化疗药物，如紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、嘌呤类抗代谢药物均有一定的直接或间接杀伤肿瘤血管内皮细胞的作用[7]。DKLEMENT 等[8]的实验显示，活性增殖的内皮细胞较增殖的肿瘤细胞对化疗药物更敏感，理论上可通过降低化疗药物的浓度以特异性地靶向于肿瘤内皮细胞。低浓度的化疗药物长期持续使用，避免了常规化疗方案中内皮细胞在化疗间歇期的恢复，增加其抗血管生成效果，起到长期抑制肿瘤作用，且内皮细胞遗传性状稳定，不易产生耐药，由于所需剂量小(通常是最大耐受量的1/10～1/3)，对机体无明显毒、副作用。因此，国外将这种连续、规律的低剂量化疗称为抗血管生成化疗[9]。DDP是一种细胞周期非特异性抗肿瘤药物，它通过与DNA链结合，形成交叉联接，抑制DNA、RNA合成和细胞有丝分裂，从而抑制肿瘤生长，该药已用于多种实体肿瘤的治疗，是目前较为有效的化疗药物之一。本文结果显示，DDP组肿瘤的MVD和VEGF表达水平较对照组明显下降，表明低剂量DDP具有抗血管生成作用。本实验结果与谭光宏等[4]的报道一致。
　　IFN抗血管形成的作用已为人们公认，IFNα更是第一个作为抗血管生成剂用于临床的药物。其抗血管形成的机制为抑制VEGF、碱性成纤维细胞生成因子（bFGF）、基质金属蛋白酶（MMP）等的表达，通过抗增生作用直接抑制内皮细胞的生长，造成内皮细胞凋亡等。本文结果显示，IFN组肿瘤的MVD和VEGF表达水平较对照组明显下降，表明IFNα具有抗血管生成作用，与文献结果一致[10]。
　　国外有关研究表明，低剂量抗血管生成化疗药物的抗肿瘤效果可因合用一种特异靶向于内皮细胞的药物而明显提高[11]。本研究中，低剂量DDP与抗血管生成药IFNα联合应用组MVD和VEGF表达水平较各自单独应用时下降更为明显，提示二者具有协同抗血管生成作用。因肿瘤血管生成是涉及多个因素相互作用的过程，其机制可能因药物分别作用于血管生成过程的不同环节而产生协同作用。因此，只针对其中的某一环节难以完全阻止肿瘤的血管生成，只有联合应用作用于血管生成不同环节的抗血管生成剂才可能更有效地抑制肿瘤血管的生成。
　　本文结果显示，各用药组的平均瘤质量均低于对照组，但联合组比DDP组和IFN组下降更明显， 抑瘤率也最高。从各用药组小鼠体质量变化及小鼠饮食、活动及一般状况来看，低剂量DDP和IFNα合用时毒、副反应未增加，但其抑瘤作用更显著，反映了二者具有协同抗肿瘤作用。
　　综上所述，低剂量DDP和IFNα联合应用具有协同抗血管生成作用，并且抑瘤效果显著，毒、副反应小。这种抗血管生成联合治疗将为肝细胞癌治疗的临床研究提供一种新的思路。
【

参考文献

】
　　[1]MILLER K D， SWEENEY C J， SLEDGE G W J R. Redefining the target: chemotherapeutics as antiangiogenics[J]. J Clin Oncol， 2001，19(4):11951206.

　　[2]BELLO L， CARRABBA G， GIUSSANI C， et al. Lowdose chemotherapy combined with an antiangiogenic drug reduces human glioma growth in vivo[J]. Cancer Res， 2001，61(20): 75017506.

　　[3]沈方臻，王秀美，陈滇宝. 富勒醇对小鼠移植性肝癌抑瘤作用的初步研究[J]. 青岛大学医学院学报， 2006，42(3)：242243.

　　[4]谭光宏，魏于全，田聆，等. 猪endoglin重组蛋白疫苗和低剂量顺铂联合治疗肿瘤研究[J]. 海南医学院学报， 2006，12(1):1319.

　　[5]TANAKA F， OYANAGI H， TAKENAKA K， et al. Glomeruloid microvascular proliferation is superior to intratumoral microvessel density as a prognostic marker in nonsmall cell lung cancer[J]. Cancer Res， 2003，63(20):67916794.

　　[6]FOLKMAN J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent[J]? J Natl Cancer Inst， 1990，82(1):46.

　　[7]KERBEL R S. Tumor angiogenesis: past， present and the near future [J]. Carcinogenesis， 2000，21(3):505515.

　　[8]KLEMENT G， HUANG P， MAYER B， et al. Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an antiVEGFR2 antibody in multidrugresistant human breast cancer xenografts [J]. Clin Cancer Res， 2002，8(1)：221232.

　　[9]GATELY S， KERBEL R. Antiangiogenic scheduling of lower dose cancer chemotherapy[J]. Cancer J， 2001，7(5):427436.

　　[10]王鲁，汤钊猷，孙惠川，等. 抗肿瘤血管形成剂抑制肝癌生长及转移的实验研究[J]. 中华肝胆外科杂志， 2002，8(12):723727.

　　[11]BROWDER T， BUTTERFIELD C E， KRA LING B M， et al. Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drugresistant cancer [J]. Cancer Res， 2000，60(7):18781886.