关于黑质网状带GABAB受体对大鼠运动行为的影响

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【摘要】 目的 观察黑质网状带GABAB受体激活对大鼠运动行为的影响。方法 大鼠单侧黑质网状带埋置套管，恢复3 d后，于清醒大鼠核团分别微量注射生理盐水、GABAB受体激动剂巴氯芬(1 mmol/L)、GABAB受体阻断剂CGP55845A(1 mmol/L)、CGP55845A和巴氯芬的混合物0.2 μL，观察其旋转行为的变化。结果 单侧黑质网状带微量注射巴氯芬，大鼠立刻出现明显的对侧旋转行为，与盐水对照组比较，差异有统计学意义（u=0.00，P&<0.01）。这种对侧旋转行为可以被CGP55845A所阻断，与单纯注射巴氯芬相比，差异有统计学意义（u=0.00，P&<0.01）；仅注射CGP55845A本身并不会产生明显的旋转行为（u=9.00，P&>0.05）。结论 黑质网状带GABAB受体激活可抑制其神经元兴奋性，从而解除基底神经核对丘脑及大脑皮质运动区的抑制效应，导致运动功能增强。
【关键词】 黑质 巴氯芬 受体 GABAB 旋转
　　［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the effect of GABAB receptor activation in substantia nigra pars reticulata on the rat behavior. MethodsA guide cannulus constructed from stainless steel was implanted into the substantia nigra pars reticulata. After three days of recovery， 0.2 μL of solutions containing GABAB receptor agonist baclofen， GABAB receptor antagonist CGP55845A， CGP55845A＋baclofen separately， or normal saline of same volume were microinjected into the substantia nigra pars reticulata in awake rats. Rotational behavior was observed within 30 min. ResultsUnilateral microinjection of baclofen (1 mmol/L) caused a robust contralateral rotation， the times of rotation were significantly higher than that of the control animals (u=0.00，P&<0.01). The rotation could be prevented by comicroinjection of 1 mmol/L CGP55845A (u=0.00，P&<0.01）. Microinjection of 1 mol/L CGP55845A only did not cause any rotation (u=9.00，P&>0.05). ConclusionGABAB receptor activation inhibits the activity of neurons in substantia nigra pars reticulata， which in turn increases the movement output from thalamus and cortex.
　　［KEY WORDS］substantia nigra; baclofen; receptor， GABAB; rotation
　　形态学和电生理学研究结果表明，黑质网状带主要含有GABA能神经元，其一方面接受来自纹状体和苍白球的GABA能抑制性纤维投射以及其自身GABA能投射神经元轴突侧支的支配[1]；另一方面，黑质网状带接受来自丘脑底核的谷氨酸能兴奋性纤维投射[2]。因为黑质网状带传入纤维的主要成分为GABA能传入神经纤维，其功能在很大程度上依赖于GABA能神经传递。GABA作为脑内最重要的抑制性神经递质，其功能活动主要受促离子型GABAA受体和促代谢型GABAB受体介导。形态学研究已证实，黑质网状带表达高密度的GABAB受体以及GABAB受体的结构异构体GABAB1和GABAB2[3]。全细胞脑片膜片钳实验记录的结果显示，黑质网状带GABA受体激活可产生突触前及突触后效应[4]。为进一步了解整体动物黑质网状带GABAB受体激活是否具有生物学效应，本实验采用核团微量注射的方法，观察GABAB受体对清醒大鼠运动行为的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物及分组
　　实验选用健康成年雄性Wistar大鼠22只，体质量200～250 g，由青岛市药检所提供。随机分成4组:①正常对照组（6只）：右侧黑质网状带内注射无菌的生理盐水注射液0.2 μL ；②巴氯芬组（6只）：右侧黑质网状带内注射GABAB受体激动剂巴氯芬(1 mmol/L)；③CGP55845A组（5只）：在大鼠右侧黑质网状带内注射特异性GABAB受体阻断剂CGP55845A(1 mmol/L)0.2 μL；④CGP55845A＋ 巴氯芬组（5只）：右侧黑质网状带内注射CGP55845A(1 mmol/L)和巴氯芬(1 mmol/L)的混合物0.2 μL。观察黑质网状带注药后 30 min 内动物的旋转行为。
　　1.2 试剂及来源
　　巴氯芬购自Sigma公司（美国），CGP55845A购自Tocris公司（Bristol， 英国），水合氯醛购自上海化学试剂公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 黑质网状带埋置套管 Wistar大鼠在室温（22±1）℃，保持12 h白天、12 h黑夜循环的环境下饲养，自由饮水和进食。手术当天，大鼠用80 g/L水合氯醛（400 mg/kg）静脉注射麻醉，俯卧位，用耳杆固定在立体定位仪上(Narishige，日本)，头部正中切口，剥离骨膜，使前后囟位于同一水平面。用三棱针在颅骨表面钻孔，清除脑膜，参照大鼠脑图谱，将长13 mm、内径0.3 mm、外径0.4 mm自置不锈钢套管垂直置入右侧黑质网状带(前囟后5.3 mm， 正中线旁开2.5 mm，颅骨表面下8.4 mm)，将一小螺丝钉固定于颅骨表面，用502胶和自凝牙托粉固定套管，并置入不锈钢内芯防止阻塞。
　　1.3.2 旋转行为测试 大鼠经过术后3 d的恢复，进行旋转测试。在清醒、自由活动的状态下，将大鼠放入直径25 cm的圆形容器内20 min，使其适应环境。针芯拔出后，将与1 μL微量注射器相连的注射针插入套管中。注射针头长于外套管的边缘2 mm。分别将巴氯芬(1 mmol/L ) 0.2 μL，CGP55845A(1 mmol/L) 0.2 μL，CGP55845A(1 mmol/L )和巴氯芬(1 mmol/L )的混合物0.2 μL及无菌生理盐水注射液0.2 μL，通过微量注射器缓慢均匀地注入到黑质网状带，均在2 min内注射完毕，注射完毕后均留针1 min。拔针后观察大鼠30 min内自发性旋转的圈数（r）。头部对侧旋转360°计为＋1 r，同侧旋转360°计为-1 r，最后将数字相加得出最终的旋转次数。
　　1.3.3 组织学检查 大鼠行为学测试后，经颈动脉灌注40 g/L的多聚甲醛，脑取出后冷冻30 min，用冷冻切片机将脑切成20 μm厚的脑片，在显微镜下观察注射点的位置。只有注射位置正确的大鼠，其数据才被用于统计分析中。
　　1.3.4 统计学处理 实验所得数据以±s表示，数据之间比较使用非参数ANOVA(KruskalWallis)法及MannWhitney U方法。
　　2 结　　果
　 大鼠右侧黑质网状带注射巴氯芬产生明显的自发性对侧旋转行为，每30 min为（34.8±5.1）r。大部分大鼠在注药后立即出现对侧旋转行为，旋转高峰出现在注药后5～20 min，旋转行为可以持续30～40 min，个别大鼠注射1 h后仍存在对侧旋转行为。对照组大鼠无明显旋转行为，每30 min为（0.8±0.8） r。黑质网状带注射CGP55845A不会产生明显的旋转行为，每30 min为（2.4±3.5 ） r。注射CGP55845A和巴氯芬的混合物仅产生微弱的对侧旋转行为，每30 min为（6.8±2.6） r。4组大鼠之间的旋转行为差异有显著意义（H=15.06，P&<0.01），巴氯芬组与对照组相比差异有显著性（u=0.00，P&<0.01），CGP55845A组与对照组相比没有统计学意义（u=9.00，P&>0.05）。CGP55845A并巴氯芬组与巴氯芬组相比旋转圈数明显降低，差异有统计学意义（u=0.00，P&<0.01）。
　　3 讨　　论
　　黑质网状带是基底神经核重要的传出核团。基底神经核通过直接通路和间接通路在机体运动功能调节中发挥重要作用。直接通路起源于纹状体的一群GABA能神经元，其传出纤维直接与黑质网状带的GABA能神经元形成抑制性突触联系，可抑制这些投射神经元的活动。间接通路则起源于纹状体的另一群GABA能神经元，经过苍白球和丘脑底核的中继，最终由丘脑底核的谷氨酸能投射纤维与黑质网状带神经元形成兴奋性突触联系，可易化黑质网状带的兴奋性。正常情况下，这两条通路的活动在大脑皮质调控下处于复杂的平衡状态，可保证机体具有正常的随意运动功能，若这种平衡状态被打破则会产生多种运动功能障碍性疾病。已有报道，黑质网状带神经元放电频率及放电模式的改变与帕金森病密切相关[5]。黑质内Fe3+含量升高可使纹状体内多巴胺释放量和含量均降低，铁含量高可能参与帕金森病的病理改变[6]。此外，黑质网状带亦在癫痫发作中起重要的调节作用[7，8]。
　　GABAB受体广泛分布于包括黑质网状带在内的基底神经核核团[9]。受体免疫电镜研究显示，黑质网状带的突触前膜和突触后膜均有GABAB受体表达，而且黑质网状带突触前膜GABAB受体可分别位于兴奋性谷氨酸和抑制性GABA能突触末梢上[9]。众所周知，突触前膜GABAB受体可作为自身受体及异源受体关闭Ca2+通道而减少GABA及谷氨酸的释放，从而对神经元产生解除抑制以及抑制两种相反的效应。然而，突触后膜GABAB受体则通过激活K+通道，使神经元发生超极化反应，从而对神经元产生抑制效应。离体脑片电生理研究结果显示，GABAB受体激活可超极化黑质网状带神经元，并可减少GABA释放[4]。由此可见，黑质网状带GABAB受体激活一方面可通过超极化神经元以及减少谷氨酸释放抑制核团兴奋性；另一方面，GABAB受体激活可通过减少GABA释放从而提高核团兴奋性。

转贴于 根据已建立的基底神经核通路联系， 单侧黑质网状带兴奋性降低，可解除基底神经核对丘脑及大脑皮质等运动传出区域的抑制效应，运动传出增强，致使动物呈现双侧运动功能不对称，从而出现对侧旋转行为。以往的文献报道，单侧黑质网状带内注射GABAA受体激动剂或谷氨酸受体拮抗剂[10]，均可通过降低黑质网状带兴奋性导致大鼠对侧旋转行为或者姿势的不对称。
　　本实验结果显示，在整体及清醒状态下，大鼠黑质网状带注射GABAB受体激动剂巴氯芬可产生明显的对侧旋转行为，该结果提示巴氯芬通过激活黑质网状带突触后膜GABAB受体而超极化神经元，并激活突触前膜受体，减少谷氨酸释放，从而对黑质网状带发挥抑制效应。当然，巴氯芬亦可通过激活位于黑质网状带内的GABA能突触末梢的受体减少GABA释放，从而发挥解除神经元抑制的效应。然而，在整体条件下，其抑制效应占优势。鉴于黑质网状带在基底神经核环路中所起的重要作用，本研究为进一步深入探讨基底神经核内GABAB能突触传递在癫痫及帕金森病等神经源性疾病中的意义提供了初步的理论和实验依据。

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