关于口服含pMG36EP30重组质粒的乳酸乳球菌对小鼠免疫应答的影响

【摘要】 目的 用含pMG36EP30重组质粒的乳酸乳球菌口服免疫小鼠，观察其所诱导的小鼠细胞及体液免疫类型。 方法 BABL/C小鼠随机分成疫苗免疫组、乳球菌对照组、生理盐水组，每次分别饲喂5×109个悬浮在缓冲液中的重组乳酸乳球菌、不含重组质粒的乳酸乳球菌及等体积生理盐水。于第27、34及48天从鼠尾静脉取血，分离血清，ELISA法检测免疫球蛋白G(IgG)、γ干扰素（INFγ）、白细胞介素4（IL4）水平。结果 疫苗免疫组IgG水平与乳球菌对照组、生理盐水组比较差异有显著性（F=134.97， q=20.33、19.90，P&<0.01）。疫苗免疫组INFγ、IL4水平与生理盐水组及乳球菌对照组比较差异均有显著意义(F=79.20、17.05，q=6.18～16.79，P&<0.01)。结论 该口服疫苗能引起小鼠特异性的体液免疫反应并能促进细胞免疫应答。
【关键词】 乳酸乳球菌 pMG36EP30重组质粒 免疫测定 小鼠
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the changes of immune response in mice after oral vaccination with recombinant lactococcus lactis expressing P30 of toxoplasma gondii.MethodsSixtoeightweek old BALB/C mice were randomly pided into three groups: vaccinated group， nonvaccinated control group， normal saline group. They were separately given 5×109 recombinant L.lactis cells (vaccinated group)， L.lactis (nonvaccinated control group) and normal saline (saline group). Serum samples of immunized mice were collected on day 27， 34， and 48， respectively. IgG， INFγ and IL4 were measured with ELISA. ResultsCompared with the control group， the levels of INFγ， IL4 and IgG in the serum of immunized mice showed significant increase （F=17.05，79.20；q=6.18-16.79；P&<0.01）.ConclusionOral immunization with recombinant L.lactis can significantly induce the humoral immunity of mice and enhanced Th1 immunity response.
　　［KEY WORDS］lactococcus lactis; PMG36EP30; immunoassay; rats
　　乳酸口服疫苗使用安全方便，可诱导机体的体液和细胞免疫，同时能够诱导黏膜免疫[1～3]。本研究用含重组质粒pMG36EP30的乳酸乳球菌口服免疫小鼠，观察该口服疫苗对小鼠免疫应答的影响。
　　1 材料和方法
　　1.1 菌株
　　含pMG36EP30重组质粒的乳酸乳球菌由南华大学寄生虫学教研室提供。
　　1.2 试剂
　　小鼠γ干扰素（INFγ） 、白细胞介素4（IL4）检测试剂盒及HRP羊抗鼠IgG购自晶美公司，其余试剂均为国产分析纯产品。
　　1.3 实验动物
　　健康雌性BABL/C小鼠60只，体质量为（18±1）g，由中国科学院上海实验动物中心提供。随机分成疫苗免疫组、乳球菌对照组、生理盐水组，每组20只小鼠。
　　1.4 口服免疫方法
　　疫苗免疫组于第1、2、3、28、29、30、35天每次饲喂5×109个悬浮在缓冲液中含pMG36EP30重组质粒的乳酸乳球菌，乳球菌对照组相同时间饲喂同量不含重组质粒的乳酸乳球菌，生理盐水组饲喂同等体积的生理盐水，口服免疫方法见文献[1、2]。分别在第27、34、48天从鼠尾静脉取血，分离血清，置20 ℃保存。
　　1.5 小鼠血清IgG检测
　　以纯化复性后的P30 蛋白(5 mg/L)100 μL于4 ℃包板过夜，次日去包被液，用0.5 g/L TBST洗 板3次， 含50 g/L脱脂奶粉的TBST封闭1 h，再以0.5 g/L TBST洗板3次。加50 μL 1∶50稀释的小鼠血清， 2 h后， 0.5 g/L TBST洗板3次， 加1∶1 000 稀释的HRP羊抗鼠IgG反应1 h， 0.5 g/L TBST洗板5次， 每孔加入50 μL TMB，37 ℃显色5～10 min， 每孔加入2 mol/L h3SO4 50 μL终止反应， 酶标仪检测波长490 nm处的吸光度（A）值。

1.6 细胞因子的检测
　　末次免疫后2周，分离5只小鼠的血清用于细胞因子INFγ、IL4水平的检测，操作步骤按试剂盒说明书进行。
　　2 结　　果
　　2.1 特异性抗P30 IgG的检测
　　疫苗免疫组IgG水平与乳球菌对照组、生理盐水组比较差异有显著意义（F=134.97，q=20.33、19.90，P&<0.01）；生理盐水组与乳球菌对照组比较差异无显著性（q=0.42，P&>0.05）。见表1。
　　2.2 各组细胞因子的测定
　　疫苗免疫组INFγ、IL4水平与生理盐水组及乳球菌对照组比较，差异均有显著意义(F=79.20、17.05，q=6.18～16.79，P&<0.01)。
　　3 讨　　论
　　含乳酸菌的口服疫苗由于可诱导黏膜免疫应答，所以特别适合用于研制抵抗经黏膜侵入宿主的病原体疫苗。乳酸菌具有佐剂作用，这也是乳酸口服疫苗的另一个优点[3]。 Th1细胞多分泌 IFNγ、IL2，与Tc细胞的增殖、分化、成熟有关，因此Th1细胞可促进细胞介导的免疫应答，Th3细胞多分泌 IL4、IL5、IL6、IL10，与B细胞增殖、成熟和促进抗体生成有关，故可增强抗体介导的免疫应答。通过检测由Th1 和Th3细胞分泌的细胞因子、特异性　　表1 各组血清中特异性抗P30 IgG水平比较表2 各组血清中INFγ、IL4的检测结果比较
　　IgG，可以分析该口服疫苗所能引起的系统免疫应答。本研究结果显示，含重组质粒pMG36EP30的乳酸乳球菌口服免疫小鼠，可使小鼠血清中特异性抗P30 IgG的水平明显提高，说明引发了体液免疫反应。本文结果亦显示，疫苗免疫组血清中INFγ水平升高，IL4水平下降，说明该口服疫苗诱导了Th1型占优势的免疫应答，Th3型免疫应答被抑制。Th1型免疫应答的增强有利于杀灭存在于细胞内的病原体，可用于研制预防细胞内感染病原体的疫苗。弓形虫是一种寄生在有核细胞内的原虫，其主要的感染部位是黏膜，所以乳酸口服疫苗对于研制弓形虫疫苗具有明显的优势。

参考文献

[1]KAREN R， LISA M C， KARIN M S， et al. Oral vaccination of mice against tetanus with recombinant Lactococcus lactis[J]. Nature Biotechnology， 1997，15:653657.

[2]LIU X F， HU J L， ZHANG X， et al. Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium expressing Helicobacter pylori urease B subunit[J]. Chin Med J， 2002，115(10):15131516.

[3]朱翔，杨秋林，陆惠民. 乳酸乳球菌表达弓形虫棒状体蛋白1[J]. 中国人兽共患病杂志， 2002，18(5）：54.