关于TRAIL在正常椎间盘细胞中的分布及表达

【摘要】 目的 了解肿瘤坏死因子超家族成员TRAIL在正常椎间盘不同部位中的表达及TRAIL/DR4诱导的细胞凋亡情况。方法 将31个包括髓核、纤维环及软骨终板的正常椎间盘组织制成石蜡标本后切片，免疫组化方法检测TRAIL的表达，计算阳性细胞所占的百分比。结果 在髓核、纤维环及软骨终板中存在TRAIL的表达，其中髓核中TRAIL表达高于纤维环及软骨终板，纤维环中表达最低，差异有显著性（F=23.51，q＝3.190～9.526，P&<0.05）。结论 TRAIL在正常椎间盘组织的不同部位存在着区域性分布，在正常椎间盘组织中可能存在着由TRAIL/DR4诱导的第3种凋亡途径。
【关键词】 细胞凋亡 椎间盘 肿瘤坏死因子
［ABSTRACT］ObjectiveTo determine the distribution pattern of tumor necrosis factor superfamily member TRAIL in normal intervertebral disc. MethodsSamples of normal intervertebral disc tissues including nucleus， annulus and endplate (n=31) were processed into paraffin sections. Immunohistochemical staining was followed to check the expression of TRAIL. Areas of positive staining were counted and analyzed microscopically. ResultsExpression of TRAIL was found in areas of nucleus， annulus and endplate. Higher percentage of positive staining was noticed in the areas of nucleus than in those of annulus and endplate （F=23.51， q＝3.190-9.526， P&<0.05）. ConclusionExpression of TRAIL in the normal intervertebral disc tissue exhibits a special distribution pattern， suggesting that the apoptosis in normal discs may follow TRAIL/DR4mediated pathway.
　　［KEY WORDS］apoptosis; intervertebral disc; tumor necrosis factors
　　腰椎间盘退行性变发病原因有多种，如年龄、遗传、机械外力、吸烟等，其确切的生物学和病理生理学发病机制仍然不清楚［1～5］。正常椎间盘的退变最早发生于十几岁的青少年［4，6，7］。大量的研究显示，椎间盘退变与椎间盘细胞凋亡有关。退变椎间盘中椎间盘细胞凋亡机制仍然未阐明。在与细胞凋亡有关的众多因素中，肿瘤坏死因子超家族成员发挥了重要的作用［7］。到目前为止，已发现了3种诱发细胞凋亡的死亡因子FasL、TNFα及TRAIL，它们通过死亡诱导信号途径来促使细胞凋亡。尽管一些人研究了人体椎间盘退变中FasL、Fas受体、TNFα及其受体的表达，但肿瘤坏死因子超家族其他成员如DR4、DR5等受体及其配体TRAIL能否在正常椎间盘细胞中表达，以及它们的结合是否能诱导椎间盘组织细胞凋亡尚没有得到证实。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料及其来源
　　从20例非正常死亡的身体健康且没有椎间盘突出家族史者（年龄18～25岁）体内获得31个腰椎间盘，均包括髓核、纤维环及软骨终板。常规取材，用40 g/L中性甲醛溶液固定标本，石蜡切片，片厚3 μm。
　　1.2 TRAIL检测
　　采用免疫组化DAB染色方法。石蜡切片脱蜡至水，用蒸馏水新鲜配制体积分数0.02 h3O2室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。在温度为93～98 ℃、pH 6的柠檬酸缓释液中进行抗原修复20 min，体积分数0.05正常山羊血清（PBS稀释）室温放置20 min封闭非特异性抗原，滴加适当比例（1∶50）稀释的一抗TRAIL(Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz， Calif， USA)，4 ℃过夜。滴加1～3滴第二代生物素标记二抗工作液，室温孵育20 min。滴加第二代辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育20 min。DAB显色，苏木精轻度复染，脱水、透明、封片。
　　1.3 结果观察及数据处理
　　对每个椎间盘的3个不同部分（髓核、纤维环、软骨终板）分别进行观察分析。DAB显色结果显 示：TRAIL抗体染色的阳性细胞胞浆呈黄褐色，细胞核呈蓝色，而阴性细胞核呈蓝色，胞浆不显色。从每张切片的3个不同部位中（髓核、纤维环、软骨终板）取5～10个高倍镜视野（400倍），计数阳性细胞数及细胞总数，计算阳性细胞所占的百分比。使用SAS软件进行数据处理及统计学分析。
　　2 结　　果
　　椎间盘标本的髓核、纤维环及软骨终板中均有TRAIL表达，其阳性率分别为（18.23±4.85）%、（9.51±4.19）%、（12.43±6.07）%。髓核组织中TRAIL表达高于纤维环及软骨终板，纤维环中表达最低，差异有显著性(F=23.51，q＝3.190～9.526，P&<0.05）。
　　3 讨　　论
　　细胞表面的凋亡受体是属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的跨膜蛋白，它们包括Fas（Apo1/CD95）、TNFR1、DR3/WSL、DR4/TRAILR1和DR5/TRAILR2。其配体属于TNF家族。正常椎间盘的细胞凋亡是维持椎间盘细胞数量动态平衡的基本措施。新生儿的椎间盘髓核中的软骨细胞死亡数较胎儿时期增加；3～10岁儿童髓核中细胞死亡明显增加［6，7］。本实验中椎间盘组织取自健康无椎间盘突出病史的18～25岁的青年，免疫组化染色可以发现TRAIL阳性细胞，虽然其表达率较低，但在髓核中的表达均高于纤维环，说明此年龄段正常椎间盘也存在细胞凋亡，椎间盘细胞出现退变。
　　在分子及细胞水平上椎间盘细胞内基质退变的一系列变化导致了椎间盘复合体的生物力学方面的失调［8］。在10～15岁时椎间盘的血供减少可引起椎间盘组织成分的退变，11～16岁时可以看到椎间盘的各种退变，细胞死亡明显增加与软骨细胞的广泛增殖有关；17～20岁时，椎间盘中细胞死亡的数量明显减少，而颗粒状改变、裂隙和撕裂增加；21～30岁时，椎间盘细胞死亡的数量及程度均越来越大；31～70岁，椎间盘退变非常明显，到70岁以上时几乎没有细胞死亡［9］。

　　曾有报道，退变椎间盘髓核细胞中低氧、低糖及酸性环境影响着其代谢率及基质的产生和细胞的存活率［10，11］。纤维环中大多数是纤维细胞，氧负荷减小，所以凋亡发生最少。软骨终板可以随着年龄增大出现广泛和严重的钙化，血供减少，细胞数量减少［6，12～14］，但其可以直接从椎体获得血液供应。所以，软骨终板细胞凋亡的数量会比髓核中减少。本文结果显示，软骨终板中阳性细胞的表达介于髓核与纤维环之间，与Fas及FasL在特发性脊柱侧弯和神经肌肉性侧弯的椎间盘及突出椎间盘中的表达相似［9］。提示在正常退变椎间盘组织中可能存在着TRAIL/DR4途径诱导的细胞凋亡，即椎间盘退变过程中TRAIL/DR4途径与其他两条途径一样也发挥着作用，引起椎间盘退变。在有的椎间盘中细胞凋亡的比例很低，原因不是很明确，可能是因为个体差异或者体内存在着能阻断TRAIL与DR4结合的某些因子，从而抑制或减缓凋亡进行。相反，某些椎间盘中凋亡细胞的比例较高，除了可能与年龄有关外，也与可能存在与其体内炎性因子诱导受体及配体的结合有关。
　　总之，本项研究为椎间盘退变的细胞凋亡机制提供了进一步的依据，为腰椎间盘突出疾病的发病机制的阐明及治疗开辟了崭新的途径。
【参考文献】
［1］FREEMONT A J， WATKINS A， LE MAITRE C， et al. Current understanding of cellular and molecular events in intervertebral disc degeneration: implications for therapy［J］. Pathol， 2002，196:374379.

［2］HORNER H A， URBAN J P. Effect of nutrient supply on the viability of cells from the nucleus pulposus of the intervertebral disc ［J］. Spine， 2001，26:25432549.

［3］BUCKWALTER J A. Aging and degeneration of the human intervertebral disc ［J］. Spine， 1995，20:13071314.

［4］NERLICH A G， SCHLEICHER E D， BOOS N. Immunohistologic markers for agerelated changes of human lumbar intervertebral discs ［J］. Spine， 1997，22:27812795.

［5］刘勇，胡有谷，宁斌. 人退变椎间盘细胞培养及细胞凋亡的研究［J］. 青岛大学医学院学报， 2005，20（3）：445446.

［6］WEILE R， CHRISTOP H， NERLIC H， et al. Expression and distribution of tumor necrosis factor alpha in human lumbar intervertebral discs: a study in surgical specimen and autopsy controls ［M］. Lippincott Williams && Wilkins， Inc， 2005:4453.

［7］BOOS N， WEISSBACH S， ROHRBACH H， et al. Classification of agerelated changes in lumbar intervertebral discs［J］. Spine， 2002，27(23):26312644.

［8］WEILER C， NERLICH A G， ZIPPERER J， et al. Expression of major matrix metalloproteinases is associated with intervertebral disc degradation and resorption［J］. Spine， 2003，25:11351136.

［9］ANDERSON D G， TANNOURY C. Molecular pathogenicfactors in symptomatic disc degeneration［J］. Spine， 2005，5(6 Suppl):260S266S.

［10］CHEN B， FELLENBERG J， WANG H， et al. Occurrence and regional distribution of apoptosis in scoliotic discs［J］. Spine， 2005，30(5):519524.

［11］BIBBY S R， JONES D A， RIPLEY R M， et al. Metabolism of the intervertebral disc: effects of low levels of oxygen， glucose， and pH on rates of energy metabolism of bovine nucleus pulposus cells［J］. Spine， 2005，30(5):487496.

［12］BIBBY S R， Urban J P. Effect of nutrient deprivation on the viability of intervertebral disc cells ［J］. Eur Spine， 2004， 13(8): 695701.

［13］BIBBY S R， JONES D A， LEE R B， et al. The pathophysiology of the intervertebral disc［J］. Joint Bone Spine， 2001， 68(6): 537542.

［14］HOLM S， HOLM A K， EKSTROM L， et al. Experimental disc degeneration due to endplate injury［J］. Spinal Disord Tech， 2004，17(1):6471.

转贴于